第八章 比色分析

比色分析是基于溶液对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，又称吸光亮度法。
有色物质溶液的颜色与其浓度有关。溶液的浓度越大，颜色越深。利用光学比较溶液颜色的深度，可以测定溶液的浓度。
根据吸收光的波长范围不同以及所使用的仪器精密程度，可分为光电比色法和分光亮度法等。
比色分析具有简单、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于微量组分的测定。通常中测定含量在10-1～10-4mg·L-1的痕量组分。比色分析如同其他仪器分析一样，也具有相对误差较大（一般为1%～5%）的缺点。但对于微量组分测定来说，由于绝对误差很小，测定结果也是令人满意的。在现代仪器分析中，有60%左右采用或部分采用了这种分析方法。在医学学科中，比色分析也被广泛应用于药物分析、卫生分析、生化分析等方面。

光是一种电磁波。自然是由不同波长（400～700nm）的电磁波按一定比例组成的混合光，通过棱镜可分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种颜色相连续的可见光谱。如把两种光以适当比例混合而产生白光感觉时，则这两种光的颜色互为补色。图8-1中处于同一直线关系的两种色光（如绿与紫、黄与蓝）互为补色。 当白光通过溶液时，如果溶液对各种波长的光都不吸收，溶液就没有颜色。如果溶液吸收了其中一部分波长的光，则溶液就蜈现透过溶液后剩余部分光的颜色。例如，我们看到KMnO4溶液在白光下呈紫红色，就是因为白光透过溶液时，绿色光大部分被吸收，而其他各色都能透过。在透过的光中除紫红色外都能两两互补成白色，所以KMnO4溶液呈现紫红色。 同理，CuSO4溶液能吸收黄色光，所以溶液呈蓝色。由此可见，有色溶液的颜色是被吸收光颜色的补色。吸收越多，则补色的颜色越深。比较溶液颜色的深度，实质上就是比较溶液对它所吸收光的吸收程度。表8-1列出了溶液的颜色与吸收光颜色的关系。 表8-1　溶液的颜色与吸收光颜色的关系

溶液颜色		绿	黄	橙	红	紫红	紫	蓝	青蓝	青
吸收光	颜色	紫	蓝	青蓝	青	青绿	绿	黄	橙	红
	波长／nm	400～450	450～480	480～490	490～500	500～560	560～580	580～600	600～650	650～760

当一束平行单色光（只有一种波长的光）照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液（图8-2）。
yiyonghuaxue286.jpg光吸收示意图
图8-2 光吸收示意图
设入射光的强度为I0，溶液的浓度为c，液层的厚度为b，透射光强度为I，则
yiyonghuaxue287.jpg（8-1）
式中lgI0/i 表示光线透过溶液时被吸收的程度，一般称为吸亮度（A）或消亮度（E）。因此，上式又可写为：
A=Kcb（8-2）
上式为朗伯-比尔定律的数学表示式。它表示一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。
式中，K为吸光系数，当溶液浓度c和液层厚度b的数值均为1时，A=K，即吸光系数在数值上等于c和b均为1时溶液的吸光度。对于同一物质和一定波长的入射光而言，它是一个常数。
比色法中常把
称为透光度，用T表示，透光度和吸光度的关
系如下：
yiyonghuaxue289.jpg（8-3）
当c以mol·L-1为单位时，吸光系数称为摩尔吸光系数，用ε表示，其单位是L·mol-1·cm-1。当c以质量体积浓度（g·ml-1）表示时，吸光系数称为百分吸光系数，用E1%1cm表示，单位是ml·g-1·cm-1。吸光系数越大，表示溶液对入射光越容易吸收，当c有微小变化时就可使A有较大的改变，故测定的灵敏度较高。一般ε值在103以上即可进行比色分析。
如果测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图可得一条曲线，即物质对光的吸收曲线，可准确地描述物质对光的吸收情况。
图8-3是几种不同浓度的KMnO4溶液的吸收曲线，溶液对波长525nm附近的绿光吸收量最强，而对其他波长的光吸收较弱。光吸收程度最大处的波长叫做吸收波长，用λmax表示。不同浓度的KMnO4溶液所得的吸收曲线，最大吸收波长都一致，只是相应的光被吸收的程度不同。
吸收曲线可作为比色分析中波长选定的依据，测定时一般选择λmax 的单色光作为入射光。这样即使被测物质含量较低也可得到较大的吸光度，因而可使分析的灵每度较高。
若所测定的溶液无色，可在测定前加入适当的显色剂，通过与待测成分的化学反应使溶液晱色即可测定此待测成分。
例如， 已知在525nm处KnO4溶液的ε=2235L· mol-1·cm-1，若用2cm比色皿，为使所测得的透光率介于20%～65%之间，溶液的浓度范围应是多少？
yiyonghuaxue290.jpgKMnO4液的吸收光谱曲线
图8-3　KMnO４液的吸收光谱曲线
解：若T=20%
则
yiyonghuaxue291.jpg
则　c=-lg65%/2235*2.0=4.19*10-5(mol·L-1)

比色分析法通过比较溶液对光的吸收程度以测定物质的含量。

（一）比色测量仪器的基本部件
比色测量仪器一般包括以下五大部件（图8-4）。
yiyonghuaxue292.jpg比色测量仪器部件示意图
图8-4 比色测量仪器部件示意图
1．光源
在光电比色计和可见光分光亮度计中，采用6～12V的钨灯，其最适宜的波长范围是360～1000nm，为使光的强度稳定，须用稳压装置来稳定电压。
2．波长控制器
在光电比色计中采用滤光片作为波长控制器。滤光片是有色玻璃片，其作用是从光源发出的连续光谱中分出实验所需的某一特定波长范围的光，即获得适当波长的近似单色光。
选择滤光片的原则是滤光片最易透过的光，也就是溶液最易吸收的光。即滤光片的颜色与溶液的颜色应互为补色，这是因为有色溶液对它的互补色光有最大的吸收。581-G型光电比色计通常只有红、绿和蓝三块滤光片。例如，要测定KMnO4溶液，就应选用绿色滤光片。
分光光度计采用单色器来控制波长。它可以把连续波长的光分解，从中得出任一所需波长的更纯的单色光。单色器包含有狭缝调节、透镜系统以及色散元件。
图8-5为自准式单色光器。光源发出的光经入射狭缝由凹面准直镜反射后的平行光投在棱镜上，经棱镜色散后的光又经准直镜反射到出射狭缝，转动棱镜便可在出射狭缝得到所需波长的单色光。
yiyonghuaxue293.jpg自准式单色光器示意图
图8-5　自准式单色光器示意图
yiyonghuaxue294.jpg硒光电效应示意图
图8-6　硒光电效应示意图
3．吸收池
吸收池供比色时盛溶液用，它是用无色透明、厚度均匀的玻璃制成的。其透光的两面严格平行。同一系列的测定中，所用的比色皿必须配套，即同一配套比色皿盛有同一溶液在同一波长时测得的透光率误差不得越过0.5%。实验时可根据溶液的浓度不同选择。0.5,1.0,2.0,3.0cm不同规格的比色皿。比色皿要保持清洁，透光面要注意保护，不得用手直接接触或用粗糙的滤纸擦拭，以免划伤表面，影响吸收程度。若外壁有液珠，应用滤纸吸干后再用擦镜纸擦净。
4．光电转换器
它是将光能转换成电信号的器件，常用的有光电池和光电管。
光电池常用的硒光电池如图8-6，适用 于380～750nm波长范围。当光线照射到光电池时，电子从半导体表面逸出。由于硒的半导体特性而在电路中产生光电流。将光电池与一个灵敏检流计相联，在照射光强度不太大且外电路电阴很小时，光电流大小与照射光的强度成正比。因此可根据光电流的大小测量透过溶液的光强度。
硒光电池的优点是光电流较大，可不必经过放大而直接用灵敏检流计测量。有时当光电池受强光照射或连续使用时间太长时，容易产生“疲劳”，这时需使其在暗的状态下暂作恢复，方可继续使用。
光电管由封装在真空透明管中的一个半圆柱型阴极和一个丝状阳极组成（图8-7）。阴极凹面有光电发射材料层，被光照射可发电子。当两极间加有电压时，发射出来的电子就流向阳极产生光电流。发射出的电子数目与射在该表面上光束的强度成正比。光电管产生的电流啼弱，经放大器放大后可由微安电表直接指示出吸光度或透光率。
yiyonghuaxue295.jpg光电管线路示意图
图8-7　光电管线路示意图
yiyonghuaxue296.jpg吸光度和透光率标尺
图8-8　吸光度和透光率标尺
5．检流计
用光电池作光电转换器的比色测量仪器中，检流计一般采用悬镜式光电反射检流计，其灵敏度较高，能测量10-9A（安培）的电流。检流计有吸光度A和百分透光率T（%）两种刻度标尺，可直接读数（图8-8）。
标尺上透光率T是等分的而吸光度A的刻度是不均匀的。透光率T可用小数或百分率表示。A与T的关系可推导为：
yiyonghuaxue297.jpg
例如，已知某溶液对某一波长的光吸光度为0.04，其透光率可由下面方法求得。
0.04=-lgT
lgT=-0.40
T=0.398=39.8%
又如,已知某溶液对某一波长光的透光率为65%,吸光度为:
yiyonghuaxue298.jpg581-G型光电比色计光学线路示意图
对于用光电管作光电转换器的仪器,由于加了放大器,可方便地连接微安电表、记录仪，数字显示器等指示器，也可以调节电桥平衡的方式读数取数据。
（二）比色测量仪器
1．光电比色计
光电比色计用光电池和检流计测量透射光的强度并直接可读出百分透光率T（%）或吸光度A。图8-9是581-G型光电比色计的示意图。它是利用滤光片把钨灯产生的白光中与测定无关的光除去，使入射光尽可能是接近溶液补色的单色光，从而提高了比色分析的准确度。
yiyonghuaxue299.jpg721型分光光度计光学系统示意图
图8－9　581-G型光电比色计光学线路示意图
图8-10　721型分光光度计光学系统示意图１.光源　２.,8.聚
光透镜　３.棱镜　４.准直镜5.,11.保护玻璃 6.入射狭缝 7.
平面镜 9.吸收池10.光门 12.光电管 13.光栅
2．721型分光光度计
721型分光光度计的工作波长范围为360-800nm。采用真空光电管作为光电能量转换元件，在整个可见光区都比较灵敏。同时采用晶体管放大电路和电表直读结构，仪器的灵敏度和稳定性都比较好。
图8-10为721型分光光度计的光学系统示意图。由光源发出的连续辐射于聚光镜上，经平面镜转角90度反射到入射狭缝，射入单色器。入射光经过准直镜反身射在出射狭缝上，再经过聚光透镜后进入比色皿。经溶液吸收后的透射光通过光门照射在光电管上转换为光电流信号，经过入大后输入检流计，由电表直接显示吸光度。

无论是光电比色计还是分光亮度计，最常用的测量方法有如下两种。
（一）标准曲线计
先配制一系列不同浓度的标准溶液，用选定的显色剂显色。选用合适波长的入射光（光电比色计用滤光片，分光亮度计可转动波长调节器）。测定时先以空白溶液调节透光率100%，然后分别测定标准系列的吸亮度。以吸亮度为纵坐标，浓度为横坐标作图得到一条通过原点的直线，叫做标准曲线（或称工作曲线）。
例如，测定维生素B12时，可预先绘制维生素B12的A-c标准曲线（图8-11），再用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸亮度，即可从标准曲线上找出被测溶液的浓度或含量。
这种方法叫做标准蛐线法。标准曲线可在固定仪器和方法的条件下多次使用，适合于经常性工作。但若仪器不同或测定方法及条件改变，测得的标准曲线不同。因此在更换任何测定条件时都需重新绘制标准曲线。
yiyonghuaxue300.jpg维生素B12的标准曲线
图8-11 维生素B12的标准曲线
（二）直接比较计算法
若仅对个别样品进行测定，且A-c曲线线性良好，可水作标准曲线而直接比较测定结果。
先配制一个被测物质溶液浓度相近的标准溶液，与被测溶液在相同条件下测定吸光度。根据下式可以计算。
A标=K标c标b标
A测=K测c测b测
由于使用同一波长的入射光，采用同样的比色皿，测定同样的物质。所以
K标=K测
b标=b测
因此A标/A测=c标/c测
则c测=A测/A标×c标

应用比色分析测定溶液中伯的含量有硫氰酸盐显色法、磺基水杨酸法及邻菲罗啉显色法等各各种方法。现以磺基水杨酸法为例介绍铁的含量测定。
在不同酸度下，Fe3+和磺基水杨酸生成组成不同的配合物。若控制溶液PH值在8-11.5的条件下显色，可生成配位数为6的黄色三磺基水杨酸合铁配合物。反应式如：
yiyonghuaxue301.jpg
上式可简写为
yiyonghuaxue302.jpg
溶液的最大吸收波长λmax=420nm，因此可在420nm 处进行测定（若用光电比色计测定可选择蓝色光片）。此方法适合于测定无大量Cu2+、Ca2+、Cr3+、Ni2+等离子存在的溶液中铁离子的含量。

（一）标准曲线的绘制 称取一定量硫酸铁铵[NH4Fe(SO4)2·12H2O]用蒸馏水溶解，加适量配制成含 Fe3+0.1lg·L-1的标准溶液，再稀释成含Fe3+0.025mg·L-1的操作溶液。 取25ml容量瓶6只，编号后分别加入操作溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00及5.00ml，各加入10%NH4CL溶液2ml和10%磺基水杨酸溶液2ml，滴加氨水至溶液由紫红色变为黄色，并使氨水稍过量，然后用NH4CL-NH3缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，以1号为空白，在420nm处依次测定吸光度。以Fe3+含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （二）样品的测定 取25ml容量瓶1只，准确加入经过处理的浓度在标准范围内的被测溶液，按上面标准系列配制的同样加入等量的显色剂和缓冲溶液，在相同条件下测定被测溶液的吸光试，利用标准曲线找出样品溶液的浓度，根据样品溶液的稀释倍数，求出样品的含量。 例如，用磺基水劣根性酸法比色测定微量铁含量。称取0.432g硫酸铁铵溶于水，加18%硫酸溶液1ml，转移至500ml容量瓶中，用水定容，作为标准溶液，其浓度为0.1g·L－1。取下列不同体积的上述溶液于50ml容量瓶中，加入显色剂后定容，在420nm处测定吸光度，结果如下：

溶液体积/ml	1.00	2.00	3.00	4.00	5.00
吸光度A	0.097	0.200	0.304	0.408	0.510
c/(g·L-1)×103	2.00	4.00	6.00	8.00	10.00

以吸光度A值为纵坐标，标准溶液中Fe3+含量为纵坐标作图，即得如图8-12的标准曲线。 吸取待测液样品5.00ml于50ml容量瓶中，加入显色剂后定容，其方法与绘制标准曲线相同，测得吸光度为0.341。由标准曲线查得A为0.341时，c为6.60×10-3g·L-1。故样品溶液中铁离子的浓度为 c=6.60×10-3×50.00×1/5.00 =6.6×10-2(g·L-1) yiyonghuaxue303.jpg磺基水杨酸法测定铁的标准曲线 图8-12　磺基水杨酸法测定铁的标准曲线