第七章 基因定位

基因定位可从家系分析、细胞、染色体和分子水平进行研究，同时由于使用手段的不同派生出多种方法，不同方法又可联合使用，互为补充。现仅就几个主要方法加以说明。 1．体细胞杂交法 体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞。将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传学研究的学科称为体细胞遗传学（somatic genetics）。体外培养细胞可人为控制或改变环境条件，并可建立细胞株，长期保存，进行各种正常和病理研究。与基因定位有关的是体细胞杂交（somatic cell hybridization）。细胞杂交又称细胞融合（cellfusion），是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞（hybrid cell）进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞（hybridcell)，含有双亲不同的染色体。杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号染色体上（图7－1）。这是首例用细胞杂交法进行的基因定位。由此可见，研究基因定位时，由于有杂种细胞这一工具，只需要集中精力于某一条染色体上，就可找到某一基因座位。 yixueyichuanxuejichu085.jpg体细胞杂交基因定位示意图 7－1 体细胞杂交基因定位示意图 2．克隆嵌板法（clone panel method）是应用杂种细胞保留或丢失人染色体有时有重叠现象而设计的一种简便有用的基因定位方法。如表7-2所示，选择3个都保留有4条人染色体的杂种细胞克隆，但染色体各不相同。如果某一表型特征只出现于克隆A、C而不见于B，就可决定该特征的基因只能在3号染色体上，因为A、C克隆都有3号染色体，而B克隆则无，其它亦可同理判断这样3个克隆可对8条（23=8）染色体作出判断；如果是5个克隆（25=32）就可对人类22条常染色体和2条性染色体作出判断。例如半乳糖激酶（GK）、尿苷-磷酸激酶（UMPK）和氨基已糖苷酶A（HEXA）的基因就是用此法分别定位于人的17号、1号和15号染色体上的。此外，还可对杂种细胞进行特殊染色，来识别杂种细胞中人和鼠染色体，以助基因定位。 表7-2 克隆嵌板示意

杂种克隆	保留的人染色体
	1	2	3	4	5	6	7	8
A	+	+	+	+	-	-	-	-
B	+	+	-	-	+	+	-	-
C	+	-	+	-	+	-	+	-

在体细胞杂交基础上还发展了微细胞（micro cell）技术，即制备只含少数或一条人染色体的微细胞进行细胞杂交。也可将人中期染色体进行分离直接转移到鼠类细胞中，使人染色体在受体细胞中裂解变成短的DNA片段，并整合到受体细胞的基因组中。如两个基因同时整合进去，就证明它们的紧密连锁关系。 3．原位杂交和荧光原位杂交 重组DNA技术的建立与分子杂交相结合，从分子水平研究基因定位，发展了一系列有效方法。例如原位杂交（in situ hybridization）就是分子杂交技术在基因定位中的应用，也是一种直接进行基因定位的方法。分子杂交的基本原理是碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链或DNA-RNA链在一定条件下能结合成双链，用放射性或非放射性物质标记的DNA或RNA分子作为探针，可探测到细胞基因组中的同源部分。19770-1978年首次将分子杂交法应用于基因定位，即用α及β珠蛋白基因的cDNA为探针，与各种不同的人/鼠杂种细胞进行杂交，再对DNA杂交情况进行分析，找出cDNA探针与人染色DNA顺序间的同源互补关系，从而将人α及β珠蛋白基因分别定位于第16号和第11号染色体上。 yixueyichuanxuejichu086.jpg用原位杂交法将胰岛素基因定位于11p15 图7-2 用原位杂交法将胰岛素基因定位于11p15 原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。所谓原位即指标本上DNA原位变性，在利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针杂交后，通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位置，从而进行准确的基因定位。图7-2表明用此法将胰岛素基因定位于11p15。但原位杂交必须在已知探针的情况下方可进行，而在未知致病基因时，则无法进行基因定位。 放射性同位素标记核酸探针与染色体显带结合进行原位杂交仍有不少缺点和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊实验室，自显影曝光时间长，同位素标记的探针不易保存，放射污染不利健康，特别是高质量的中期染色体标本在细胞培养基础上难以得到，观察费时，对间期核的研究难以进行等。 荧光原位杂交（florescencein-situ hybridization,FISH）是一种非放射性原位杂交方法。用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，对检测细胞内DNA或RNA的特定序列存在与否最为有效。探针不是放射性的而是将荧光染料与抗体蛋白结合进行检测。它们具有高度亲和力，有与放射性探针相同或更高的分辩率。现已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽。这种多色FISH技术近年来发展迅速，已成为基因定位作图和医学诊断的重要手段。1992年运用这种策略已能在中期染色体和间期细胞同时检测7个探针。科学家们的目标是实现24种不同颜色来观察22条常染色体和X、Y染色体。荧光原位杂交法提高了杂交分辩率，可达100-200kb。此法降低应用于基因定位外，还有多种用途，它已日益发展成为代替常规细胞遗传学的检测和诊断方法，在此不多论述。 4．连锁分析基因 定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在着两个相邻的基因座位，距离较远，发生交换的机会较多，则出现基因重组；若两者较近，重组机会较少。重组DNA和分子克隆技术的出现，发现了许多遗传标记——多态位点，利用某个拟定位的基因是否与某个遗传存在连锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体的一定部位，使经典连锁方法获得新的广阔用途，成为人类基因定位的重要手段。 染色体上两个位点从亲代传给子代时，若相距1cM，就有1%的重组机会。整个人类基因组含3.2×109bp，相应约有3300cM，每个染色体平均约有150cM，1cM约为1000kb。因此，一个致病基因和标记位点紧密连锁，二者不须在同一条染色体的同一区段，一条染色体可以产生大量的DNA多态，只要提供足够的家系，按孟德尔方式遗传的疾病都可将其基因定位。 图7－3表示某一致病基因与一多态位点的关系。父（Ⅰ1）是显性遗传病患者，基因型为DN，他妻子（Ⅰ2）正常，基因型为NN，多态标记位点父为Aa,母为AA，在子代中，除Ⅱ4外，都是致病基因与多态标记位点的完全连锁，即都遗传了父亲的A基因和D基因，或是a基因和正常N基因。据此信息，就可确证父亲的致病基因是多态标记A基因连锁在同一染色体上，而Ⅱ4则是重组体，而具有标记基因A的个体并不都是患者，Ⅰ2就是这样，所以，在连锁分析中，多态标记是极为有用的。 yixueyichuanxuejichu087.jpg致病基因与标记位点的边锁关系图 图7-3 致病基因与标记位点的边锁关系图 在人类基因组中还存在约50000－100000个串联重复序列家族，它们均匀穿插于基因组，平均50kb有一个，这些都是很好地遗传标记对突变的检测和基因定位研究起了重要作用。正如本章开始提到，至1993年10月已经发现多态标记总数为5964个，从分子水平进行基因定位，还有不少有效的新技术，它们相互配合使用，使基因定位得到迅速发展。此外，利用染色体自身结构及染色体畸变法进行缺失作图和基因剂量法等。总之，人们已不只是用单一技术进行基因定位，而是将细胞、染色体和分子水平技术结合起来，综合分析，互相印证，以达快速、准确的目的。

基因定位和基因图对遗传学、医学和人类及生物进化的研究都有十分重要的意义。它可提供遗传病和其他疾病的诊断的遗传信息，可以指导对这些疾病的致病基因的克隆和对病症病因的分析与认识，这些又取决于遗传图和物理图的相互依赖关系。通过多态位点标记进行连锁分析获得物理图的位置有助于遗传作图，同时通过连锁分析（部分有减数分裂的交换）又能指导物理作图，使基因定位更为精细。
1．连锁分析检测基因突变指导遗传病的诊断 通过遗传连锁图可以在缺少任何生化或分子性质信息情况下对遗传病进行诊断。例如应用RFLP进行的临床诊断（详第十三章）。应当指出，由于多种遗传标记的定位，使RFLP的应用更加广泛。遗传图对疾病诊断的价值最明显的是当某一基因已被定位于某染色体，但尚未被克隆时，就可依赖于运用一个或多个遗传标记进行连锁分析，利用它和该基因的重组关系进行基因诊断。
2．连锁分析进行致病基因的鉴别与定位 前段说明已知疾病基因与遗传标记相关进行连锁分析以诊断疾病，然而要认识这种关系就需要：①有足够数量家系来确定这种连锁；②有适当可提供信息DNA标记。后者较易，前者则难，尤其是稀少的疾病，患者在年幼时死亡。这时采取两种方法，一是少数的大家系，并从此家系成员中获得DNA信息，其优点是所有患者都是一个遗传病，并由单一基因突变引起；二是收集大量的小家系。前者如慢性进行性舞蹈病，后者如囊性纤维化（CF）。实际上，人们希望能发现连锁需在大约20cM距离或以下，再大的距离一般就难于发现连锁关系，特别是分子遗传学的新进展推出的反向遗传学――位置克隆的策略，更加速了疾病基因的鉴定与定位。
3．促进对癌基因和瘤抑制基因的定位与克隆，从慢性粒细胞白血病的Ph染色体的发现，了解到是染色体9和22的易位，以及Burkitt淋巴瘤染色体t(8：14)。1982年证实c-myc癌基因定位于8q24，并对其基因分子的结构有了深入认识。现今已知有100多种癌基因和约10种肿瘤抑制基因。而且肿瘤细胞遗传学异常的报道日益增多，到1993年10月，与染色体畸变相关的肿瘤总数达239种，其中结构畸变有188，数目畸变为51种。这些资料就充分说明基因定位和克隆对肿瘤的鉴别定位及其深入研究有着密切关系。当然，基因定位与基因图的发展，也推动了许多常见复杂病的遗传因素的研究。
4．位置克隆与基因定位 基因定位的重要应用之一是据此进行基因克隆（gene cloning）。致病基因克隆有两种基本策略：一是功能克隆，二是位置克隆。
（1）功能克隆（funetional cloning）：是利用疾病已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质基酸缺陷的信息，进行基因定位，进而克隆该致病基因。以进行的基因克隆大都是预先测知疾病基因的编码蛋白质，利用其mRNA反转录成cDNA，再用cDNA作探针，从人基因组中“约”出基因本身。然而，绝大多数遗传病的基因产物不明，就无法用功能克隆策略进行基因克隆。
（2）位置克隆（positional cloning）：是先进行基因定位作图，然后找一来自该区的基因并进行克隆，在此之后才能明确该基因的功能。早先称之为逆向遗传学（reverse genetics），但究其基因鉴定到基因定位制图的全过程并非都是“逆向”的，而具遗传学的传统模式，故现多称其为位置克隆。
据HGM93国际会议的资料，至1993年，运用位置克隆策略克隆的人类疾病基因共有26个，其中1993年就有11个，如慢性进行性舞蹈病（HD）基因，肝豆状核变性（Wilson病，WND）基因等。位置克隆的操作过程如图7－4所示。
遗传病致病基因运用位置克隆的成功例子很多，典型之一是假肥大型肌营养不良（DMD）基因的克隆。学者们利用受累女性X染色体与常染色体21的易位，以及男患儿发生小的Xp21.2缺失并伴发3种其它X连锁隐性遗传病，再运用RFLP连锁分析将DMD基因定位于Xp21。Ray等利用了X与21号染色体基因易位，于1986年克隆了该基因的一部分，即XJ系列探针。Kunkel等于同年利用男患儿（B.B）的DNA，通过灵敏的技术提纯得自有Xp21.2缺失的片段，即后来称为pERT87系列的探针。虽然细胞遗传学检查未见此缺失，但患者的DNA中确有
yixueyichuanxuejichu088.jpg位置克隆操作过程图解
图7－4 位置克隆操作过程图解
yixueyichuanxuejichu088.jpgpERT87系列探针对7个DMD患儿的Sorthern印迹分析
图7－5 pERT87系列探针对7个DMD患儿的Sorthern印迹分析
图中患儿1、7无缺失，2－6出现缺失，所有患儿均未见细胞遗传学的缺失
pERT87的缺失，这说明该片段可能是DMD基因的一部分。图7－5表示用DNA印迹杂交法，观察到pERT87区附加的缺失片段（87－1、87－2、87－18等），而且缺失片段不断向此克隆区两侧扩大，表明DMD可能是一个很大的基因。
为证明该区的DNA片段是否含有DMD基因的外显子，又用Northern印迹法检测一个16kb的特异肌肉转录物，接着克隆出它的cDNA，最后证明DMD基因的确很大，约为2300kb，占X染色体的1％以上，该基因编码肌营养不良蛋白(dystrophin)，并测出它的氨基酸顺序，该蛋白影响纹肌和心肌的结构和收缩功能。
关于基因定位，近年又兴起一种候选基因方法（candidate gene approach）。此法无需经过基因图和物理图的过程，而根据某种遗传病和特定基因分别定位于染色体的同一区域，而后再发现并鉴定其基因突变，则可研究此致病基因。自1992－1993年用此法克隆基因已有十几个，如SOD1（肌萎缩性侧索硬化症）、RET（多发性内分泌促瘤2A型）基因等。

基因定位取得了巨大成就，新的分子生物学技术不断发展与完善，使许多学者认为已到了对人类基因组全部30亿bp，5－10万个基因进行整体制图和测序的时候，以达到人类基因组完善而系统认识的目的。1985年美国学者提出了人类基因组项目（human genome project），引起学术界巨大反响和热烈争论，经两次会议研究后，1988年美国国会批准，由国立卫生院（NIH）和能源署（DOE）负责执行，此后成立了国际性组织――HUGO（human genome organization），组织了国际性的合作研究。这是一项耗资数十亿美元，全球性的大科学项目，预计2005年可完成基因组顺序分析，这将对生命科学的发展作出巨大的理论和实用价值的贡献。
1990年美国又建立了国家研究中心和国内若干大的中心。1992年法国研究组构建了1－1Mb YAC文库，生产了大量的遗传标记，首先绘制出21号染色体长臂的重叠YAC克隆，引起了科学界的轰动。HUGO先后于1988－1993年每年召开一次人类基因组的国际会议。1992年在巴西还召开了第一次南北人类基因组会议，使发展中国家也参与了这项研究，并提出“人类遗传多样性项目（human genetic diversity project），得到与会各国支持。我国与于1993年正式组织人类基因组研究，标志我国也正式参与了这基世界性宏伟科学研究工程。
人类基因组项目主要目标与程序：①研究人类遗传的基础结构；②确立人类生物学的DNA顺序；③进行基因的生化分析，也就是要进行人类基因定位。全部核苷酸顺序的分析，有助于了解结构，认识功能，亦即人类能够“读出”并“读懂”人类基因组的全部ATGC语言，从遗传学来认识人类正常功能和病理变化，也是从分子水平来认识人类自身的结构与功能特征。
人类基因组全顺序分析分两大步骤：即制图（mapping）和测序（sequencing），同时发展人类和模型生物基因定位和测序的新技术。全过程又可分为4个阶段（phases）如图7－6所示：①构建1cM的遗传图；②构建物理图；③建立重叠克隆系（cntig）；④；完成核苷酸顺序测定。当然这4个阶段是相互交叉进行的。由于新技术的不断涌现，现今定位的基因与日俱增，许多DNA多态遗传标记的运用，已可制作相邻标记平均距离为5cM的基因或DNA片段，其中有的已达1－2cM。1995年可制出1-5cM的遗传图。物理图的制作在用FISH技术和YAC库后，已可制出多色细胞遗传图谱，分辩率可达100-200kb。全自动化测序仪不断更新，极大提高了测序的准确性和效率。
yixueyichuanxuejichu089.jpg人类基因组研究阶段示意图
图7－6 人类基因组研究阶段示意图
A.1cM的基因图构建；B。物理图构建；
C．建立重叠序列测定；D核苷酸序列测定
人类基因组项目的研究重要内容包括致病基因的鉴定、克隆与分析（图7－7）。这不仅局限于孟德尔式的单基因遗传病，还包括人类肿瘤和众多常见复杂病等。研究的成果不仅使人们从分子水平阐明各种疾病发生的机理，同时也认识正常生物学结构和功能，其最终成果必将是巨大的，甚至尚难以预料所产生的深远影响，但至少可以看出，它将促进从整体到细胞水平全面深入发展为分子医学，并揭示人类自身的奥秘，用遗传学语言来阐明生命的本质和各种生命现象。
yixueyichuanxuejichu090.jpg7号染色体的基因图示
图7－7 7号染色体的基因图示
7号染色体上已定位的遗传病，不包括已定位的DNA片段及其他未导致遗传病的基因