1．幽门螺杆菌的分子生物学研究

自从1983年Marshall和Wsrren报道从人胃粘膜活体标本中成功的分离出幽门螺杆菌（helicobacter pylori, Hp）以来，国内外学者对此进行了广泛深入的研究。近年来分子生物学技术初步显示了它在流行病学、分子遗传学学及其临床应用上的价值。

诊断Hp感染的方法很多，包括快速尿素酶试验、Warthin-Starry银染以及细菌培养，这些方法的共同缺点是不能达到足够的敏感性以确定治疗后细菌是否被彻底根除，也不能确定Hp感染的来源和传播途径。13C和14C呼吸试验方法虽然可靠，但费用较高。血清抗体的检测则不能确定是否有新近感染，也不以评价治疗的效果。而近年来发展起来的分子生物学技术简单、快速、可靠，不仅对Hp的诊断具有高度敏感性和特异性，而且还可以用于对Hp的分型。
最早的研究方法是用限制性核酸内切酶直接消化培养，鉴定后的Hp染色体DNA，经过琼脂糖电脉按大小分离所得的片段，来比较各株细菌的基因组DNA酶切图型。Langenberg等报道了用HindⅢ限制性内切酶分析Hp的全基因差异。Wetherall等用斑点杂交法评价了同位素与非同位素标记Hp全基因探针的实用性。Mortomi等通过DNA-RNA杂交方法，用人工合成的Hp特异性寡核苷酸探针，同16SrRNA序列互补，证实这种探针比较敏感，可以检出少至5000个～10000个Hp。
近年来聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）技术已经用于Hp的诊断，该技术的敏感性比寡核苷酸探针增加了100倍，可以检出少至100个Hp。目前Hp的尿素酶基因和16SrRNA基因的部分序列已经测出，为PCR特异性引物的选择提供了依据。我们以一对与16SrRNA基因互补的寡核苷酸为引物（CP1/CP2），建立了从胃粘膜活组织标本中检测Hp感染的PCR技术。用该方法检测Hp标准菌株NCTc 11637，NCTC11848及50株从临床病人胃粘膜活组织中分离的Hp菌株均产生450bp的片段，其敏感性为0.1pg的HpDNA，相当于100个细菌细胞，而对12株非Hp菌株（包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌及空肠弯曲菌NCTC11351）以及无Hp感染的人胃粘膜细胞呈阴性反应。我们还用PCR检测了96例因上消化道症状而行胃镜检查的患者，结果表明PCR检查的Hp阳性率高于常规检查法。我们还对17例经不同方案治疗后用常规方法检查（尿素酶试验、银染、及培养均阴性）而被认为Hp被根除的病人，用PCR检查发现4例Hp阳性。以往我们对一些常规方法未能检出而实际上还存在Hp的病人，误认为Hp被根除而放弃治疗，这些病人短期内Hp再现实际上是治疗不彻底，这对于指导Hp感染的治疗有十分重要的临床意义。
PCR还可以从石蜡包埋的胃粘膜组织中检测Hp，因此可以对胃及十二指肠患者进行回顾性研究。PCR的另一个优点是可以成功地检出人胃粘膜以外的用常规方法不能检测的Hp，包括胃液、唾液、牙菌斑及粪便中的Hp。用巢式引物（nested primer）双扩增(reamplification)或同时在引物扩增序列内部选择一寡核苷酸作探针，对PCR扩增产物进行southernblt检测，则可使敏感性增加10倍～100倍，可检出难以培养的球形Hp。

因为PCR检测Hp的敏感性高、特异性强、检查快速；HindⅢ限制性内切酶可以分析Hp全基因差异，可以用它来鉴定Hp菌株，所以分子生物学技术作为Hp流行病学的研究工具，其敏感性和特异性远远超过Hp的常规检查法，因而有利于确定Hp感染的来源和途径。Langenberg等报道1例在前几次胃镜检查时经细菌培养和组织学检查证明为Hp阴性的患者，在进行另一次胃镜检查后则变为Hp阳性。经DNA内切酶分析发现其HpDNA酶切图型完全相同，证明了经内镜检查而引起人与人之间的医源性传播。宋敏等用巢式PCR从唾液中检出了Hp，说明口—口的传播可能是Hp在人与人之间传播的另一条途径。

近年来国外文献报道，Hp染色体DNA限制性内切酶分析以及Hp的核糖核酸型可以作为Hp菌株的鉴别。Langenberg等用限制性内切酶DNA分析法研究发现，从不同病人分离的Hp菌株酶切图谱各不相同，而从同一病人1年～2年内连续分离的多株Hp，其DNA酶切图型稳定不变，因此，利用限制性内切酶的DNA消化图谱（DNA digest pattern）可以鉴别抗Hp治疗停药4W后再次出现的Hp是复发（recrudescence），还是新菌株再感染（reinfection）。
我们最近建立了PCR单链构象多态（single-strand conformation polymoophisms,SSCP）技术。该方法简单快速、敏感性强、图型简单、易于比较。PCR-SSCP不仅可以用于大规模Hp流行病学调查，而且能准确评估治疗后再现的Hp是复发还是再感染。我们对10例Hp阳性患者采用抗Hp治疗，比较治疗前后分离的菌株染色体DNA203bp片段SSCP图型，发现9例病人治疗前后的菌株具有相同的单链构象，说明是治疗上的失败，而不是新菌株现感染。
利用分子生物学技术来检测Hp才刚刚起步，对于Hp的诊断、致病机理、遗传学、流行病学及其与胃癌的关系和感染治疗的研究中还存在许多问题需要用分子生物学去研究，证实和阐明。特别是PCR技术发展迅速，日臻完善，在Hp的研究中，将有着广泛的应用前景。

慢性胃病（B型胃炎、胃溃疡等）及十二指肠球部溃疡等一类常见病、多发病，长期以来，其病因尚未阐明。1983年澳大利亚学者Warren和Marshall从慢性活动性胃炎病人胃粘膜活检标本中发现并分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori Hp）后，引起了全世界消化病学与有关基础科学的普遍关注。几年来，各国对Hp的研究迅猛发展，其中主要为临床实用性研究，有关Hp生物学特征相对较少，至于Hp具体致病机理则更少。
我们是从1985年开始与上海市消化疾病研究所合作开展这方面研究工作的，我们开初的工作（1985～1986）主要有：①在国内最早分离培养成功了Hp；②对上海地区各种慢性胃病中的Hp检出率作了调查；③用双盲法探讨痢特灵、灭滴灵治疗Hp阳性慢性胃炎的疗效，并验证Hp感染与慢性胃病人发病关系。上述研究结果表明：①我国Hp感染率与各种慢性胃病的关系和文献报道的同样广泛和密切；②根据Hp的检出率与各种慢性胃病的高度相关性、Hp感染者经适当药物治疗后与临床症状缓解，以及病理表现改善的密切程度，支持慢性胃病的Hp感染学说。1988年，我们又用Hp超声粉碎的抗原以ELISA法测定了Hp感染的慢性胃炎及消化性溃疡病人、健康体检者和新生儿血清中的抗Hp-IgG抗体，结果表明：①B型胃炎及消化性溃疡病人的阳性率明显高于A型胃炎及健康体检组；②体检组中抗Hp-IgG阳性率随着年龄组的增长而升高，30岁～50岁组达最高峰，70岁以上又稍有下降，③新生儿组抗Hp-IgG阳性率反比1/2岁～10岁年龄组为高，接近成人水平。其抗体可能通过胎盘来自母体中，提示Hp是后天获得感染。上述人群中，抗Hp-IgG抗体水平调查的结果又增强了慢性胃病的Hp感染之说。
1987年我们微生物学教研室以“弯曲菌样细菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物学地位及致病物质的研究”课题名称申请得到国家自然科学基金的资助。由此对Hp的生物学性状作了比较全面系统的研究，企图对Hp的生物学地位及致病机理作一些探讨。

1.1 材料 ①标本1985年5月～1989年10月分别取自上海市仁济医院、纺二医院、新华医院有上消化道主述病人的内窥镜检查标本。②菌种Hp均分自病人。除药敏试验和与空肠弯曲菌的交叉反应者外，都以88065，88073，88082，88109，88152五个菌株作为代表进行试验研究。 参考菌种：空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni,CJ）CJ-3276株和结肠弯曲菌F（Campylobactercoli,CC）CC-3278株由法国Borbeaux儿童医院Megraud博士惠赠，空肠弯曲菌CJ-S131由苏州医学院微生物学教研室提供。胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus,CF）日本大阪大学微生物学研究所三轮谷俊夫教授惠赠。 1.2 方法 1.2.1 光学显微镜检查 取胃粘膜活检标本或菌种培养物在洁净玻片上涂薄膜。自然干燥，加热固定，革兰染色后油镜检查。另取胃粘膜活检标本作石蜡包埋切片，四苯胺兰（touidine blue）染色镜检。 1.2.2 分离培养 空肠弯曲菌选择性基础琼脂（上海市卫生防疫站生产）中补充以10%羊血和1%可溶性淀粉，并每1000ml培养基中加入1ml万古霉素（10mg/ml），1mlTMP(5mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后，置Queue三气培养箱（美国产），气体调节至5%O2，85%N2和10%CO2，37°C培养3d后观察。 1.2.3 生化鉴定 主要参考 Cliodna等方法：①氧化酶反应 用竹签挑取血平板上可疑菌落至已被1%盐酸二甲基对苯二胺（E.Mer-ck,Darmstadt产品）溶液浸透、并预先干燥过的滤纸上，10s内出现深紫红色为阳性。②触酶反应 用含3%H2O2液的毛细玻管碰触血平板上菌落，有气泡升起为阳性。③尿素酶反应 将含有菌落棉拭插入尿素肉汤中，30s内棉拭呈粉红色为阳性。④DNA酶试验 在含有甲葳胺兰核酸琼脂的平皿上打孔后，将细菌悬液加于孔中，37°C培养2h后观察结果。小孔周围出现透明小圈者为阳性。⑤碱性磷酸酶反应 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下细菌菌落。加入0.5ml1%磷酸对硝基苯脂（Beckman产品），37°C水浴1 h ,观察结果。呈黄色者为阳性。⑥亮氨酰胺肽酶反应 取小试管2只，1只测定管加待测菌液（约3×1010cfu/ml）0.05ml，另1只空白对照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸缓冲液（pH7.2）0.45ml和基质液（亮氨酰-β-萘胺盐酸20mg溶于H2O25ml，加入0.2mol/LpH7.2的磷酸缓冲液25ml，充分混匀）0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混匀后4000r/min离心沉淀10min。从测定管和空白对照管中各取上清液0.5ml分别装入另2只试管中，并分别加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混匀，室温（20°C）中静置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml。混匀后，室温（20°C）静置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二盐酸盐溶液[称取N-（1-萘）乙烯二胺二盐酸（分析纯，瑞士，Lichtemptindicht生产）100mg，溶于95%乙醇200ml中，冰箱保存可稳定1个月。临用时，以95%乙醇稀释10位后使用] 2.0ml。20min后观察结果。呈紫色为阳性。⑦马尿酸盐水解试验 接种1环48hCJ/CC培养物或72hHp培养物于0.4ml含1%马 尿酸盐水溶液的小试管中，混匀，放置37°C水浴2h，再轻轻倒入0.2ml茚三酮试剂（3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液）于各管。置37°C水浴，经10min后看结果。深紫色为阳性反应。 1.2.4 抗菌药物敏感性试验 用琼脂稀释法测定13种抗菌物（青霉素G、链霉素、庆大霉素、红霉素、先锋霉素V、四环素、痢特灵、灭滴灵、TMP、洁霉素、次硝酸铋、多粘菌素B、万古霉素）对30个（Hp）菌株（Hp菌株号：85025，85084，85114，85117，85120，85143，85187，85485，85507，85508，85524，85553，85558，85560，85562，85568，85596，85595，85621，85623，85625，85629，85634，85639，85643，85647，85648，85660，85663，85677）的最小抑菌浓度（Minimal inhibitionConcentration,MIC）。①菌液准备：待测菌株落分别用生理盐水洗下，比浊调整至108fu/ml。②药敏平板制备：分别取200ul不同种类、不同浓度的抗菌药物稀释（抗菌药物的浓度为0.05μg～100μg/ml的对倍稀释液的对倍稀释系列）置于空的无菌平皿（φ9 cm）中。每只平皿加入加热融化的血琼脂10ml，轻轻摇动使培养基与抗菌药物均匀混合。待琼脂凝固后备用。③细菌拉种：用多点接种器（M2T-P）将菌液点种于上述每只药皿平板上。每个平板点种25个菌种。置微需氧环境中培养3d后观察结果。如Hp在某个抗菌药物浓度的培养基上生长，而在前一个大一倍的尝试的培养基上不长，则以此前一个平板中的抗菌药物尝试为该菌的MIC。 1.2.5 菌种保存 挑取3～5环分纯的Hp菌种（菌号：88064，88065，88073，88075，88077，88082，88099，88108，88109，88152，88223，85289，85682，85688）于装有灭菌脱脂牛奶的Eppendorf塑料离心管，置-70°C冻存。经1年后复苏鉴定。 1.3 超微结构的研究 以Hp88065，88073，88082，88109，88152菌株及CJ-3276，CJ-131、CC3278参考菌株制成负染和超薄切片，置H-500透射电镜下观察。取新鲜采集的胃粘膜活检标本经固定后在临界点下干燥，真空涂金。在JEOLJSM0S40扫描电镜下观察。 1.4 Hp的DNAG+Cmol%与菌体脂肪酸组成测定 1.4.1 细菌DNA中G+Cmol%含量的测定 主要参赞丁鉴等高压液相色谱测定。①Hp DNA的提取；将细菌悬液经4000e/min×15离心沉淀，用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTApH8.0 溶液（SE液）洗一次后，重悬浮于10mlSE液中。加溶菌酶，使终浓度为2％的SDS，放60°C水浴15min。用等体积酚／氯仿·异戊醇（体积之比为3/1）抽提二次后，再用等体积氯仿/异戊醇（体积之比为24/1）和等体积乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/LTris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C过夜。透析后的抽提液中加入经100°C、15min处理的Rnase，使终尝试为200ug/ml，37°C,2h。加蛋白酶K，终尝试为200ug/ml，37°C轻摇2h。用等体积酚/氯仿（体积之比为1/1）和等体积氯仿·异戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M，溶解后，加入2倍体积的冷无水乙醇。混匀后，①-20°C，13000g×30min，得DNA沉淀。②游离碱基的制备：在DNA沉淀物中加入100μl72%高氯酸，使完全溶解后，移入安瓿中，熔封管口。100°C水解1h，放入4°C冰箱待用。③高压液相色谱测定：用Shimadzu LC-4A高压液相色谱义；柱为不锈钢制，4.6mm×250mm；填充材料为Nucleosil C18,5um。流动相为0.1mol/L pH3.9甲酸钠，流速0.8ml/min。压力120kg/cm2,柱温40°C检测器为UV254nm,0.02AuFs。④标准溶液的配制：用电子称（Sartorius research）分别准确称取腺嘌呤（A，,英国BDH产品），嘌呤（G，Sigma产品），胞嘧啶（C，中科院生化所产品）和胸腺嘧啶（T，上海市化学试剂公司产品）。加数滴磷酸，以高压液相色谱仪标定出峰位置。⑤碱基物相对克分子样正因子的测定和G+Cmcl1%的计算： 表1 四种碱基的分子量、毫克/分子浓度及相对克分子较正因子

碱基	Mr	混标中的量（mg）	混标中的mg分子浓度	进样量×10－3mmol/L	F-m(i)
A	135.14	4.17	0.616	6.17	1.00
G	151.10	4.60	0.609	6.09	0.95
T	126.12	6.43	1.019	10.19	1.82
C	111.12	3.94	0.709	7.09	2.37

a..相对克分子校正因子（f′m）的测定标准A，T，G，C混合溶液，在上述色谱条件下进样，测定每个峰面积。按下式计算A、T、G、C的相对克分子样正因子（fm）。

f′m(i)	=	AsmiMs
		AimsMi

式中A峰为面积，m为进样量，M为分子量，下标S为内标物（本实验以A为内标物），i待测碱基。 b.G+Cmol%计算：10μl各样测样品进样后，测出峰面积，乘上相对克分子校正因子（f′m），然后归一化，用下式

G+C mol%	=	C[3]
		T+C

计算，求得其分子百分数。 1.4.2 细菌菌体脂肪酸组成分析 主要参考I toh等方法①标准品的处理 在脂肪酸标准品(Sigma产品，EC10A偶炭链脂肪酸，OC-9奇炭链脂肪酸，UN-10不饱和脂肪酸)中加入4ml25%盐酸-甲醇后，再加入1ml NaCl溶液。用4ml已烷：乙醚=1:1（体积比）溶液萃取3次。有机相用N2吹干，最后用0.5ml已烷定量。取1μl作色谱分析，标定各峰位置。②样品的处理：在干重为10mg～20mg的细菌中加入生理盐水1ml，混均后转入磨口玻璃管中。加入含15%NaOH的水-甲醇（体积比为1:1）溶液2～4ml后，在100°C水浴中加热30min。稍冷后，加入6NHCl,使溶液pH达2.0。加入25%HCl-CH3OH溶液5ml，100°C水浴加热15min。冷却后，用N2吹干HCl至原体积的一半。加入1ml饱和NaCl溶液。用12ml1:1的乙醚-已烷溶液分三次萃取，萃取后的有机溶液放入有塞磨口离心管中。70°C水浴蒸发溶液至1ml左右。用N2吹至0.5ml左右，加入少量Na2SO4去除残余水分。4000r/min离心15min后，取上层有机相，加入1ml已烷溶解。取1μl作色谱分析。③气相色谱测定条件：色谱仪为日本岛津公司的GC-9A，色谱柱为2%的OV-101，80～100目，ChromosorbAW，W，DMCS。操作条件：柱温180°C～230°C，程序升温，升温速率4°C/min，进器温度和检测器（FIS）温度为260°C，RANGE=102。氮气压力为0.4kg/cm2，速度为30ml/min，空气压力为0.3kg/cm2。 1.5 Hp菌体蛋白电泳与与CJ间抗原交叉反应 1.5.1 Hp菌体蛋白电脉 ①样品的准备:将细菌菌苔用生理盐水洗下.在超声粉碎仪上粉碎(dute cycle 50%,time 6min。Output Control8,pulse)。然后10000r/min离心10min，4°C。上清蛋白定量。用0.01ml/LpH7.2磷酸缓冲液稀释至2mg/ml，-20°C保存。②SDS-PAGE：主要参考Blaser的方法。用pH8.3 Tris-甘氨酸作电泳缓冲液：分离胶浓度为10%；每份样品加20μl；以低分子量标准蛋白（MV17500～94000，中科院上海生化所东风试剂厂产品）作标准蛋白；在10mA恒流下电泳；考马斯兰G～250染色。 1.5.2 用Hp耐热抗原致敏的红细胞与CJ的Penner分型血清作间接血凝，测定Hp与CJ之间的交叉反应。①CJPenner分型血清的准备：CJ的Penner分型血清（由卫生部药品生物制品检验所、上海卫生防疫站及苏州医学院微生物教研室联合研制）由苏州医学院微生物学教研室提供。先将25个免疫血清分别根据特异性较强或交叉反应较多的血清组合在同一多价血清内。共分6组（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ），Penner5，29，45，52型不包括在多价血清内，每种血清使用时效价稀释成1:1280二种浓度备用。②Hp耐热抗原致敏的红细胞的制备a.Hp耐热抗原制备：将血平板上洗下的28种Hp菌株（菌号：85135A，85158，85130，85132，85155，85138，85084，85067，85031，85070，85093，85120，85157，85071，85123，85141，85113，85134，85070，85117，85142，85134B，85085，85114，85118，85030，85111，85117）的菌液，均调整至9×109／ml浓度，100°C加热1h，3000r/min离心沉淀20min。取上清备用。B.羊红细胞制备：取新鲜脱纤维蛋白羊血，离心沉淀，弃上清用pH7.0磷酸缓冲液洗3次后，3000r/min离心沉淀10min，弃上清。用PBS配成1%红细胞悬液。C.致敏：分别将28种1ml的耐热抗析与等量1%羊红细胞悬液混合均匀置37°C水浴1h。3000r/min离心10min。弃上清。用PBS洗三次，最后配成0.5%致敏红细胞悬液。③交叉凝集反应：用96孔U型塑料板，纵向分别加入Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ组多价血清及5，29，45，52型的单价血清。横向单行为1:640浓度的血清0.25μl，双行为1:1280浓度的血清0.25μl。如此准备好8块已添加CJ分型血清的96孔塑料板。然后在每两行为一组的CJ分型血清中加入一种Hp耐热抗原致敏的红细胞悬液，每孔0.25μl。待28种Hp耐热抗原致敏的红细胞悬液均加妥后，将96孔塑料板均置微型振荡器上振荡1min～2min ,使充分混匀。置37°C孵育2h后观察结果。根据凝集程度，以++++、+++、++、+、± -符号记录结果。以血清最高稀释度呈现“++”以上程度凝集者为阳性。如上交叉凝集反应中先以多份血清进行粗筛，若效价超过1:1000者，再以单价血清进行分型，效价≥1:1280者作为阳性。

2.1 Hp的基本生物学性状 2.1.1 光镜下形态结构 Hp为“S”形、“U”形或弧形杆菌。菌体宽0.3～0.5μm,长1.5～5.0μm。大多大小均匀，形态典型，革兰染色阴性。Hp较CJ/CC稍粗，两端钝圆。在陈旧培养物中，Hp常变成圆球体，在革兰染色下呈现大小不一、染色深浅不均，周围界较模糊的特征。在胃粘膜活检标本直接涂片中，多数存在于着色较浅的粘液带中，常呈鱼贯状排列，在Hp密集处，甚少杂菌混杂，在着色的组织液背镜下，Hp菌全周围常呈现有微荚膜样结构。在病理组织切片中可见，Hp多数存在胃粘膜上皮细胞表面，特别是在胃小凹。在病理切片中尚可见到在胃粘膜表面有Hp存在的附近部位常有大量中性粒细胞、浆细胞等炎症细胞的浸润。在胃的肠腺化生区域很难找到Hp，但是在十二指肠的胃化生区域却能找到Hp。 2.1.2 菌落特征及细菌动力 在微需氧条件下，经37°C72h培养，Hp形成较小菌落，直径＜1mm，呈灰白或灰色，边缘整齐，隆起的圆形菌落。打开平皿有一股特异的气味。新鲜的菌落制成湿片在暗视野下可见Hp呈螺旋状迅速向前的运动。亦可见翻滚运动。 2.1.3 生化反应特征 Hp的生化反应特征见表2。Hp均有氧化酶、触酶、尿素酶、DNA酶、碱性磷酸酶和亮氨酰酞酶，而马尿酸盐试验均阴性，CJ和CC仅有氧化酶和触酶，而CJ-S131能分解马尿酸盐。 2.1.4 Hp对抗生素的敏感性 25株Hp对13种抗菌药物的药敏性见表3。 表2 Hp、CJ和CC生化反应

试验	Hp-88065	Hp-88073	Hp-88082	CP-88109	Hp-88152	CJ-S131	CJ-3276	CC-3278
氧化酶	+	+	+	+	+	+	+	+
触酶	+	+	+	+	+	+	+	+
尿素酶	+	+	+	+	+	－	－	－
DNA酶	+	+	+	+	+	－	－	－
碱性磷酸酶	+	+	+	+	+	－	－	－
亮氨酰氨酞酶	+	+	+	+	+	－	－	－
马尿酸盐	－	－	－	－	－	+	－	－

表3 25株Hp对13种抗菌药物的药敏结果

抗菌药物	MIC（μg/ml）
	MIC50	MIC90
洁霉素	0.78	12.5
红霉素	＜0.05	0.39
TMP	＞100	＞100
先锋霉素V	0.2	25
链霉素	＜0.05	0.39
四环素	＜05	0.2
庆大霉素	0.2	0.78
青霉素G	＜0.05	0.1
万古霉素	6.25	＞100
多粘菌素B	6.25	50
次硝酸铋	3.12	25
痢特灵	＜0.05	0.2
灭滴灵	1.56	＞100

从表中可知所有被检的Hp菌株对红霉素、链霉素、四环素、庆大霉素、青霉素G及痢特灵敏感，其中特别是四环素、青霉素G和痢特灵的敏感性尤甚，MIC90分别是0.2,0.1及0.2。MIC50均＜ 0.05。Hp对TMP、多粘菌素B、万古菌素及灭滴灵耐药，大部分菌株的MIC均＞100。 2.1.5 菌种保存 15株Hp菌株，经-70°C冰箱保存一年后复苏，14株存活，对存活的14株作直接涂片革兰染色，油镜检查，其中的13株形态不变，1株成圆球体。我们又对这13株进行了氧化酶、触酶、尿素酶、DNA酶、碱性磷酸酶试验，13株Hp阳性，这与保存前相同。 2.2 Hp的超微结构 从不同病人胃粘膜上分离得Hp的形态结构基本一致,呈”S”形弯曲、弧形或稍直，偶见分枝状。一般表面较光滑，一端或二端（多数为一端）具有2～6条带鞘鞭毛，长度稍长于菌体。带鞘的鞭毛直径在30mm左右。每一鞭毛基部与菌体细胞膜上直径约50mm的圆球状结构相连。菌体末端鞭毛基础结构内侧，有一宽达200mm～400mm的电子密度明显降低区域，其基底部无明显的细胞膜结构界限。在Hp负染标本中，部分菌株在菌体周围可见大小均一、排列整齐的上百个“指”状突起，似直接为外膜的组成部分，与菌体内部结构无明显直接关系。在参考菌株中，CJ与CC末端呈圆锥体样，稍尖，顶端明显地呈吸盘样结构。CJ与CC均有单根无鞘端鞭毛从顶端的吸盘样凹陷的中心伸出。鞭毛根部均未见电子密度明显降低区域。 在胃粘膜活检标本的超薄片中可见：一般情况下，胃粘膜上皮与粘液层间不存在细菌。若出现细菌，常为大小、形态较统一的、都呈弯曲样特征的菌群。多聚居在胃小凹中或上皮细胞与上皮细胞连接处，亦常常镶嵌在微绒毛之间。偶见Hp在局部的胃粘膜上皮上定位似有明显的方向性。Hp与粘膜上皮的粘附方式有三种：Hp通过鞭毛顶端直接插入或粘附在胃粘膜上皮细胞表面；Hp菌体怀胃上皮细胞间保持一定的间距，借无数的细丝状菌毛样网状结构使两者互相粘附；Hp菌体的部分细胞壁与胃上皮细胞的细胞膜直接相贴粘附，二者间几无间距。最多见的是第二形式，有时同一细菌可同时出现两种或以上粘附形式。Hp粘附聚居外的上皮细胞除微绒毛明显减少或消失外，多数情况下很少发现有明显的细胞病理学变化。胃粘膜上皮表面有Hp粘附的邻近区域，往往有炎性细胞的浸润和渗出。胃粘膜上皮细胞中尚可偶见对Hp的吞噬现象。 2.3 Hp的DNA+Cmol%和菌体脂肪酸组成 2.3.1 Hp的DNAG+C MOL%含量测得的Hp、CJ/CC DNA G+Cmol%含量见表4 表4 Hp CJ/CC DNA G+C mol%含量

菌种	Hp-88065	Hp-88073	Hp-88082	Hp88109	Hp88152	CJ-S131	CJ-3276	CC-3278
DNA	38.3	35.7	36.8	37.5	37.3	36.3	37.9	36.1
G+C mol%

　　2.3.2 Hp ,CJ/CC菌体脂肪酸的组成 Hp 的脂肪酸组成主要是十九碳环丙烷酸(19:0cyc)、十八碳酸（18:0）、十八碳烯酸（18:1）和十四碳酸（14:0），CJ/CC的脂肪酸组成主要是十六碳酸（16:0）、十六碳烯酸（16:1）和十八碳烯酸（18:1，表5）。 表5 Hp,CJ/CC菌体脂肪酸组成

菌 种	脂肪酸组成（占总%）
	14:0	15:0	16:0	16:1	17:0	18:0	18:1	18:2	19:0cyc	19:0
Hp-88065	18.72	1.62	3.25	0.50	0.48	16.22	21.03	2.24	24.20	3.34
Hp-88073	4.90	-	2.17	-	-	26.24	39.7	-	7.33	-
Hp-88082	7.29	-	-	-	-	25.47	22.74	-	39.24	-
Hp-88109	3.68	0.87	7.02	0.63	-	21.48	31.99	2.11	27.31	-
Hp-8152	1.23	0.70	2.57	-	-	29.27	23.30	3.02	39.27	0.64
CJ-3276	1.06	-	37.42	17.62	-	-	38.89	3.83	-	-
CC-3278	6.85	-	38.82	19.39	-	-	30.23	2.29	-	-

2.4 Hp菌体蛋白电泳与CJ分型血清间的交叉反应 2.4.1 CP菌体蛋白SDS-PAGE Hp的主要条带Mr约为25100，28200，44700，62000，70800，81900，12600七条。CJ/CC条带相似，其主要条带Mr约为63000，89100和100000。 2.4.2 CP与CJ抗原交叉反应可见除CJ-22502免疫获得的Penner45型血清与绝大部分Hp菌株（28株中的19株）及PennerV组多价血清与Hp-85607有较强的交叉反应外，其余几乎无免疫学上的交叉（表6）。Hp-85067与V组多价血清的因子血清的反应结果见表7。 表7 Hp-85067与V组因子血清间的抗原抗体交叉反

	CP菌株	CJ免疫菌株号	78	77	76	75	68	65	22023
		Penner分型血清	37	36	35	34	26	23	4
	CP85067	1:640	-	-	+++	+++	+++	-	+++
	CP85067	1:1280	-	-	+++	+++	+++	-	+++

3.1 Hp的生物学地位 虽然Hp引起的世界性关注及人们对其广泛研究是在1983年以后，但早在1847年Bottcher已在人胃中发现了螺形的细菌，随后人们又从许多动物-狗、大鼠、猫的胃中发现类似细菌。1906年又从溃疡性胃癌病人的胃内容物中找到这类细菌。其他一些报告证实在健康人中不易发现它们。1939年 Doenges在242例人胃尸检的染色标本中发现有43%存在数种不同类型的螺形菌，但不明确这些菌与各种胃病间的相互关系。1954年Palmer在1000例胃活检标本中未能证实上述报告，认为前人发现地螺形菌系吞入或死后污染所致。1975年Steer和Colin-Jones报告了胃溃疡病人胃粘膜上出现细菌，经分离培养，结果是绿脓杆菌。后人仔细观察该文图片，认为胃粘膜上的细菌是一种与绿脓杆菌无关的螺形菌。在同一时期，许多学者发现多种动物胃中存在有内源性尿素酶活性。最早是1924年有Luck和Seth描述的，后在1955年Korngerg和Davies的综述中断定胃的尿素酶主要存在于胃体部，且是细菌源性的。在人类胃的研究中证实了这种酶的存在与溃疡病之间的关系，有些病人还成功地利用了尿素进行了治疗。 1983年Warren从慢性活动性胃炎活检标本的胃粘膜上皮表面发现了一种未经鉴定的弯曲状细菌，Marshall又用弯曲菌属的分离培养技术从幽门的活检标本中分离培养成功了该菌。由此，曾先后命名为GCLOs和Hp。1984年Langenberg并发现原先认为的胃中内源性尿素酶即由此菌产生。因此在1984年以前人们对Hp的生物学性状了解得比较少，只知它在光镜下呈螺形，分离培养需微氧条件，与弯曲菌属的代表菌种-空肠弯曲菌相似，只是它有较强的尿素酶活性与空肠弯曲菌不同。此后这种细菌与各种慢性胃病间的密切相关性为世界各地的学者所进一步证实。由此掀起了一股对Hp研究的热潮。 在国内，我们对Hp表型特征—生物学性状的系统研究是比较早的，其结果已如前述。根据这些结果，Hp确实与弯曲菌属的代表菌种——CJ有一些共同或相近之处，例如光镜下的形态相似，都需要微氧的条件分离培养，营养要求大致接近。培养的最适温度虽有差别，但都能在37°C生长，都能产生触酶、氧化酶，均不能利用糖类，能产生微量的H2S。对各种抗生素的敏感谱与CJ相比，绝对值虽有一些出入，但总趋势大致相仿。Hp的DNAG+Cmol%与CJ基本相同，甚至重叠在同一范围内。从这些特征，Hp与CJ同归一属似乎无可置疑。 俟后，进一步的研究发现Hp与CJ间存在着更多的本质上差别：①有一些重要的生化反应与CJ明显不同，例如尿素DNA酶，碱性磷酸酶、亮氨酰胺酞酶等，Hp均为阳性，而CJ/CC均为阴性，这与国外文献报道是一致的。②更重要的是在超微结构上Hp与CJ/CC存在着不同，特别是鞭毛、鞭毛的根部和菌体末端的外形其内侧具有“极膜”，曾提出它可能与水螺菌（Aquaspirillum，AS）同属。但不久发现AS为双极丛毛菌，一般每端只有1～2根鞭毛，Hp虽偶也可见双极鞭毛，但多数情况下只有一端有鞭毛，且为有鞘鞭毛，数量多到6根。更重要的原因是因为AS的DNAG+Cmol%为49～66，与Hp相关甚大。很快就不再有人提及。③从所测的Hp菌体脂肪酸组成来看，Hp与CJ/CC之间亦存在着明显差别，它们的主峰是各不相同的，这一特征与国外文献报道基本一致，只是我们Hp的几个主峰间的相对值与国外报道者略有上下，推测可能是地方菌株之间的差异。④按菌体蛋白电泳的主要蛋白条带，Hp与弯曲菌属的主要代表菌种之间亦存在明显的不同，Hp有7条主要条带，CJ/CC仅有3条，其中只有分子量为63000与89100的2个条带基本相同。⑤根据Hp耐热抗原与CJ的Penner分型血清的交叉反应，它们之间亦不存在有明显的交叉抗原，其中有一个值得讨论的问题是由CJ22052菌株免疫得的Penner45型血清与28株Hp菌之间有18株发生明显交叉反应。我们深感这一现象奇特，特地对22052菌株作了深入一步的研究，发现它在基本生物学性状方面确实与CJ类似，但在电镜下其菌体末端及鞭毛的特征与C明所不同。更重要的是DNA G+Cmol%仅有27.8，明显地超越弯曲菌属范围。因此，若22052菌株不属于弯曲菌属，则Hp与CJ之间基本上不存在耐热抗原的交叉。至于Hp85067菌株与的Penner26，34，35型血清之间的交叉凝集原因未明，有待进一步作出解释。 表8 Hp与CJ/CC.CF菌体末端扩鞭毛的超微结构比较

菌种		菌体末端	鞭毛特征			鞭毛根部特征
	外形*	顶端	内侧	数量*鞘
		吸盘样凹陷	电子密度降低区
CP	纯圆	-	+	2～6 + 末端球形或脱鞘状		每一鞭毛在菌体细胞膜上有一圆球状根基
CJ/CC	圆锥状	+*	-	1	-	鞭毛从吸盘样凹陷中央伸出未见圆球状根基
CF	稍钝圆	+	+	1	-	同CJ/CC

*国外文献中亦有同样报道，其他特征尚未见文献报道。 综上所述，从Hp的各方面的表型特征来看，Hp与弯曲菌属的代表菌各：CJ22052菌株菌体末端超微结构（×60000）－CJ、CC之间，差异性多于共同性，且其差异点比共同点更具有本质性。因此，我们赞同国外个别学者提出的Hp不归入弯曲菌属，而宜另立一个新属的主张。 至于Hp究竟应归入哪属细菌，Romaniuk从分析Hp，多种弯曲菌属细菌和产琥珀酸沃林菌(Wolinellasuccinogenes,WS)等的16s rRNA核苷酸序列得出结论，认为Hp与弯曲菌属关系较远，而与WS关系较近，似乎应与WS同归一属。但Hudson则认为Hp在DNAG+Vmol%(36%～38%对46%～49%)，脂肪酸组成，极性脂质（polar lipid），总蛋白电泳谱和它同时具有MK-6及TPQ-6方面与WS不同，因此不宜归入沃林氏属，他认为根据Hp的培养和形态的基本特征仍应归入弯曲菌属为宜。遗憾的是迄今还没有一个比较统一的能够应用于所有细菌的细菌学命名原则，因此对有一些难于命名的细菌免不了会引起一些争论。虽然现在对有一些细菌的研究已经开始迈入了分子遗传学的领域，但是当前以表现型特征作为分类的主要依据仍然无可置辩地具有更现实的意义。虽然几乎收集了当今世界上弯曲菌属所有的15种菌种，甚至包括Hp和WS，进行了16s r RNA核苷酸顺序的分析 。根据同源性的程度不同将它们分成三群，可是他不得不承认由于缺少对弯曲菌属各种菌种表现型特征的全面了解和也由于没有将所有的细菌都用同样的试验和同样的方法比较过，因此难于对三群细菌作出适当的专门的描述。Good-win认为由于Hp在临床上的重要性，急需把它命名学地位及早地确定下来，他对Hp、WS和弯曲菌属细菌作了超微结构和形态、菌体脂肪酸组成、甲苯醌、生长特征和酶的活力五个方面的表现型特征作了研究，他的结论是Hp不应归入沃林菌属，他提出给它命名为Helicobacter pylori（暂译为幽门螺杆菌）。我们的意见偏向于赞同他的意见，因为我们亦对一部分细菌作了系统的表现型特征的研究，除了甲苯醌我们没有做以外，我们还做了DNA G+Cmol%，菌体蛋白蛋电泳分析和与CJ的Penner分型血清之间交叉反应的研究，大部分结果都表明，Hp与CJ之间有明显的不同。 3.2 Hp的致病性 自从Warren和Marshall发现Hp后，世界各地学者相继从各种慢性胃病及十二指肠溃疡病人的活检标本中找到了Hp，且检出率都很高，从而初步确定了Hp与各种慢性胃病的密切相关性。1985年Marshall按照Koch的病原体致病性原则，吞服了Hp菌液作了自身感染实验。二位学者先后都找到了Hp在自身引起急、慢性胃炎的证据。1987年Krakowka又以悉生小猪(Gnotobioticpiglet)口饲Hp菌液液造成Hp感染的动物模型。至此，Hp直接或间接与各种慢性胃病有关已得到大多数学者的认可。但Hp的致病物质和致病机制，迄今尚未阐明。我们从超微结构研究中发现了一些在国内外文献中尚未作报道的现象，并结合光镜下的观察所见和一些有关文献，对Hp的致病机制或致病过程作出如下推断。 胃是人们对摄入的食物彻底消化前进行预处理的重要器官。在预处理过程中，伪造胃壁肌肉收缩和舒张的物理和机械作用使食物在胃中受到胃酸和胃蛋白酶的强烈化学作用而得到初步消化。本来胃的这种强力的缩舒运动及强酸，酶类作用对胃壁本身就可能造成损伤作用，但由于在胃壁粘膜表面有一层较厚的、且在不断代谢更新的不溶性粘液连续层存在，且在其表面尚有可溶性粘液层起着滋润作用，因而保护了胃粘膜。为何经口入胃的过路细菌很多，而独有Hp能透过不溶性粘液层定居于胃粘膜上皮表面？为何Hp对人胃的感染率这么高，而在不溶性粘液层下胃粘膜上皮表面几乎找不到有第二种细菌的大量存在？为何一个人一旦被Hp感染后，Hp能长期在胃中持续存在？为何用有效抗生素治疗常不能彻底杀灭胃粘膜上的Hp？所有这些问题都说明Hp的感染有其独特性。根据我们所观察到的Hp与胃粘膜之间有关系特别是Hp的三种粘附现象，我们提出Hp感染过程的假说如下。 第一步，Hp利用其特征性的菌体和鞭毛结构穿透不溶性粘液层，当Hp随食物进入胃中，首先伪造其鞭毛与胃粘膜表面的不溶性粘液层发生亲和性吸附。在不断运动着的胃壁上初步找到了一个落脚点。然后借其菌体的螺形结构，以及一端有数根象推进器样活泼运动的鞭毛使它在粘稠的不溶性液层中自由泳动。Venables报道，胃粘膜上的不溶性粘液层的化学结构是由二硫键连接的四个同等大小的亚单位组成的多聚体糖蛋白构成的。每一个亚单位以蛋白质为核心，四周围绕有碳水化合物的侧链，形似“瓶刷状”。 Hp利用其菌体及鞭毛结构上的特点可在这种平行排列的“瓶刷状”结构中作螺旋形的向前运动。 Hazell曾在模拟的粘稠环境中发现Hp比同样具有鞭毛的大肠杆菌的泳动速度快10倍。这就说明了在食物经过胃的短暂时间内，为何几乎只有Hp能透过不溶性粘液层，而其它细菌很难通过的重要原因。 第二，Hp依靠其菌体表面菌毛样网状结构稳定地定居于胃粘膜上皮细胞表面，Hp透过不溶性粘液层后首先仍然通过鞭毛在粘膜上皮表面“抛锚”。然后菌体迅速向粘膜上皮表面靠拢。伪造其菌体表面菌毛样网状结构（或称糖萼Glycocalyx）与胃粘膜上皮细胞表面紧密相连，达到比较稳定地固定在胃粘膜上皮的局部。这Hp特异性地只在胃粘膜组织或肠及食管胃化的组织上定居，而不在其他组织上定居的原因，可能在胃粘膜组织上存在有Hp的特异性受体之故。正由于它存在着特异性的较强的粘附机制，因此尽管不溶性粘液层和胃粘膜上皮以较快的速度不断代谢更新，一部分Hp随着表面的粘膜上皮和不溶性粘液层的更新而脱落，但总还是有一部分Hp在胃的不断运动中在就近的新生的粘膜表面或不溶性粘液层找到继续定居的场所。这就是造成人类的胃粘膜一旦被Hp感染后，Hp就较难以彻底消除的缘故，结果易形成持续感染的状态。这也是人胃的Hp感染率为何这么高的原因。 第三步，Hp部分细胞壁与胃粘膜上皮细胞直接相贴，依靠其脂多糖与细胞毒素等引起胃壁的病变，Hp的感染还不等于发病，只有在某种尚待探明的因素影响下，Hp菌体的部分细胞壁与胃粘膜上皮细胞直接相贴的第三种粘附机制过渡后，才由于细胞壁（这时Hp已失去包在菌体外面的一层外膜样结构）脂多糖的内毒素样作用引起局部粘膜样结构）脂多糖的内毒素样作用引起局部粘膜的炎症。另外，粘膜上皮表面大量Hp还可能由于所产生的强有力的尿素酶分解尿素后产生的氨离子阻挡H+从胃腺向胃腔通过。胃蛋白酶对粘液素的降解，细胞毒素对细胞的毒性作用等导致粘膜的溃疡。胃炎可能是溃疡的基础，反过来，溃疡又可能促进胃炎，因此慢性胃病中的胃炎和溃疡两种基本类型都与Hp感染的直接或间接作用密切相关。Hp在体外对许多抗生素是敏感的，但是由于种种原因真正能用于胃部疾病治疗的抗生素是有限的，即使有效的抗生素，由于不溶性粘液层的保护作用，亦很难将Hp彻底消灭干净。

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）与胃炎和胃溃疡的发生有关联。众所周知，胃炎与溃疡属于多发病、常见病，其病因不明。自从Warren和Marshall于1983年首先从胃炎患者的胃粘膜上皮组织中观察螺杆菌和分离到Hp，他们认为胃炎或溃疡病的发生与Hp的感染有密切的关系。近年来国外在这方面进行了不少研究工作；国内亦发现本菌在慢性胃炎及消化性溃疡的病人中检出率较高。但有关Hp的生物学特性及致病性的研究则很少。现将我们对这方面的研究结果报告如下。

1.1 材料 各型胃病患者共200例。年龄19岁～80岁，平均46.9岁。男222例，女78例。患者经胃镜检查时，均在胃窦部或求部钳取粘膜组织两块，置于含10%灭活小牛血清的布氏肉汤中放于4°C冰箱中保存，送检。
1.2 方法
1.2.1 尿素试验 参考Christtensen尿素肉汤培养和mlorris等快速诊断法,先用2%液体尿素常规法,后用10%液体尿素1min检查法及5%尿素滤纸片法,进行了对比研究。
1.2.2 直接涂片镜检 用保存液将胃粘膜研磨成匀浆后，取一滴推成涂片，甲醇固定后用0.3%碱性复红单染，于显微镜下直接检查。
1.2.3 幽门螺杆菌培养 以布氏琼脂培养基为基础，加入6%脱纤维新鲜羊血及联合抗生素（TmP5mg/L、万古霉素6mg/L、两性霉素2mg/L），制成血平皿，放置4°C冰箱中保存、备用。从送检的Hp保存液中用白金耳取出胃粘膜组织块放入玻璃研磨器中，加入0.5ml保存液，研磨成匀浆，用1ml吸管吸取0.2ml于血平皿中涂匀，将平皿置于10%CO2，5%O2及85%N2混合气体培养箱中，37°C培养72h后观察培养结果。剩下 液体匀浆于尿素酶快诊及直接涂片镜检。
1.2.4 药敏试验 抗菌药物敏感试验所用试纸系参考WHO建议的药敏试验质量控制标准及国内外有关资料制备而成，由大连生物试剂厂生产，专供用纸片扩散法来检测细菌对抗菌药物的敏感度。试验中所用菌液为用0.1%胨生理盐水洗下的37°C48h培养物，浓度为2×109cfu/ml。用1ml吸管取0.1ml菌液于血平皿上，涂匀，之后将药敏片按适当的间距平贴于平皿上，一般9m直径的平皿上贴6张药敏片。最后将平皿置于混合气体培养箱中37°C培养48～72h，观察试验结果，测量抑菌环直径。
1.2.5 杀螺杆菌抗体检测 原理：氧化酶反应阳性的细菌，由于氧化酶的作用，可使TTC用灭菌蒸馏水配成0.5%的溶液；指示菌用Hp295 37°C48h的培养物，其浓度为107cfu/ml；补体一指示菌悬液的制备：补体取4只豚鼠的新鲜分离血清，用生理盐水作1:20稀释，再加入最终浓度为1%（V/V）的指示菌，即为浓度相当于105cfu/ml的补体—指示菌悬液；微量定量板用4×10孔板。方法：①每孔先加入0.1ml生理盐水。②第一孔加入1:5被检灭活血清（取自胃病患者）0.1ml，之后顺序作从1:10～1:5120的对倍稀释。③每孔加补体—指示菌悬浮液一滴，约0.05ml。④最后每孔加入含0.01%TTC布氏肉汤0.1ml（0.5%TTC用布氏肉汤作50倍释稀。混合后盖上塑料盖，于37°C培养20～24h后观察结果。以无红色出现的孔内的血清稀释度作为被检血清的杀螺杆菌抗体的最高滴度。
1.2.6 动物试验 实验选用小鼠C57、BALb/c和金黄色地鼠（由本所动物室提供）用布氏肉汤将新培养的Hp菌洗下，浓度大约配成2×109cfu/ml，每只小鼠一次灌胃约0.5～1ml菌液，每周2次，共4次～6次，末次灌胃后3～7d，处死动物，解剖后取两块胃粘膜组织作尿素酶快诊和Hp菌培养及组织切片。
1.2.7 统计学方法 统计学方法采用X2检验。

2.1 尿素酶快速诊断 Hp能产生大量的尿素酶，分解尿素产生氨，使pH值升高，据此将尿素酶液全培养基颜色由桔黄色变为粉红色的反应定为阳性反应。试验结果如表1所示： 表 1 不同时间尿素酶快诊结果

时间（h）	受检标本数		合计	阳性率（%）
	阳性	阴性
4	165	135	300	55
24	186	114	300	62

从表中看出，4h和24h尿素酶快诊的阳性率分别为55%和62%。在300份胃病患者的胃粘膜Hp培养中，有195例为阳性。阳性率为65%，与4h尿素酶快诊阳性率之间无显著性差异，（P＞0.05）。尿素酶快诊阳性结果与Hp培养阳性结果之间的对应关系良好，培养出的195例Hp菌株作尿素酶快诊，在1min内均呈阳性反应，特异性达100%。而4h和24h尿素酶快诊的敏感性分别为84.6%(165/195)。因此用尿素酶作Hp快诊，在早期及Hp培养后进行，均有其非常特异而重要的意义。 2.2 直接涂片镜检 对其中21例作了直接涂片镜检，结果有4例镜下可见成簇Hp（+++）占19.0%；有1例镜下易找到Hp（++），占4.8%；有9例镜下可见Hp零星存在（+），占42.9%；6例镜检为阴性。镜检阳性率为66.7%。21例Hp 培养阳性为16份，阳性率为76.2%，与镜检阳性率之间无显著差异（P＞0.05）。镜检阳性符合率为87.5%(14/16)。 2.3 Hp的运送、培养及生化反应 2.3.1 运送Hp生长的营养条件很高，而从采样到分离培养需要一段时间，送检中保存问题当然重要，有文献报道将胃粘膜标本浸在20%葡萄糖液体内送检，5h之内不会影响阳性率。为了探索一条保存时间长、效果好的方法，我们试用含10%小牛血清的布氏肉汤作标本保存液，4°C冰箱保存，用冰壶送检，随机对300例胃粘膜标本进行了不同时间的分离培养，所用平皿是新配制或在密闭条件下保存备用的，增养结果是保存1～8h的标本阳性率为47.5%～78.6%，有1例标本不保存液中存放了17d后Hp培养仍阳性。 2.3.2 培养300例胃粘膜标本，培养Hp结果有195份阳性，阳性率为65.0%。菌落形态：37°C微氧条件下培养72h后，可见0.5～1mm直径大小、圆形、扁平、湿润、半透明的灰白色菌落，偶尔可见菌落周围有β微溶血现象。菌体形态：显微镜下菌体呈弧型、S型或海鸥展翅状，与空肠弯曲菌相类似。72h镜检菌体呈弧形或弯曲状，比空肠弯曲菌要大，着色较好。五日以上菌体呈多形状，有直杆形、微弯曲型或球形，着色不均匀。 2.3.3 生化反应 Hp的氧化酶、过氧化酶、尿素酶均为阳性反应。其中尿素酶反应的时间与细菌浓度成反比。葡萄糖发酵、硝酸盐还原、及3.5%NaCl反应均为阴性。马尿酸水解反应84.1%为阴性，15.9%为弱阳性。1%甘氨酸反应87.0%为阳性。0.04%2、3、5TTC反应8.6%为阳性。 2.4 药敏试验 选取22株生长良好的Hp菌作药敏试验,结果如表2所示.从表中可以看出：Hp对链霉素、四环素、氯霉素、先锋霉素、利福平、卡那霉素、红霉素、新霉素及大霉素较为敏感。而对复方新诺明、萘啶酮酸和多粘菌素B有耐受作用。另外，选用8株Hp对中医研究院研制的五种中药即Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ号及胃丹C进行了药敏试验，结果表明作用减弱，抑菌环直径分别为16～20mm，20mm，10～20mm，0mm及10～14mm。 表2 22株Hp的药敏试验结果

抗生素	药敏片药量（μg）	敏感菌株数	抑菌环直径范围	平均直径（mm）
新霉素	30	21（95.5）	16～28	24.4
庆大霉素	10	21(95.5)	14～38	22.3
四环素	30	22(100.0)	26～36	33.8
磺胺嘧啶	300	22(100.0)	10	10.0
红霉素	30	2(9.1)	22～40	25.4
痢特灵	300	20(90.9)	10～40	17.9
氯霉素	30	19(86.4)	24～38	28.6
青霉素G	10	22(100.0)	12～30	20.8
呋喃坦丁	300	20(90.9)	12～50	21.9
卡那霉素	30	21(95.5)	12～28	25.3
萘啶酮酸	30	1(4.5)	8	8.0
先锋霉素	30	20(90.9)	12～34	26.5
复方新诺明	25	0(0.0)	0	0.0
链霉素	10	22(100.0)	16～40	32.3
氨苄青霉素	10	3(13.6)	12～14	12.7
利福平	5	20(90.9)	18～32	28.9
多粘菌素B	300IU	1(4.5)	16	16.0
黄连素	100	21(95.5)	8～24	15.6
托布霉素	10	21(95.5)	10～30	21.9
丁胺卡那霉素	10	21(95.5)	12～28	23.5

注：( )内敏感百分比 2.5 杀菌杆菌抗体 对40份受检胃病患者的血清进行了杀Hp抗体的检测试验，结果见表3。根据诊断标准 ，杀Hp抗体滴度≥1:160时为阳性，则杀Hp抗体检测试验的实际阳性率为57.5%。对应40份患者胃粘膜标本Hp培养阳性者为29份，阳性率为72.5%，与杀Hp抗体试验的阳性率之间无显著性差异（P＞0.05）。 2.6 动物试验结果 ①尿素酶快诊仅BALb/c小鼠呈阳性反应，其他小鼠均为阴性。而正常BALb/c小鼠胃粘膜的尿素酶快诊也偶尔呈阳性反应，因此推测尿素酶阳性者不一定是Hp感染，由何引起有待进一步研究。②Hp培养均为阴性。③尿素本科阳性的BALb/c小鼠的胃粘膜病理组织切片检查，可见粘膜上皮中有嗜酸性染色的杆菌存在，在大量白细胞，偶尔可见形态类似螺杆菌的细菌的存在。 表3 杀幽门螺杆菌抗体试验结果

稀释度

1:10

1:20～1:80

1:160～1:640

1:1280～1:5120

合计

幽门螺杆菌所含脂肪酸种类含量与其它弯曲菌及肠道菌不同。在DNA杂交试验中，其DNA与螺旋菌或弧菌不相溶，而只与螺杆菌的DNA相容。此菌可使人罹患慢性活动性胃炎。电镜观察该菌表面粗糙，且具有许多单孔有鞘的鞭毛，且鞭毛鞘细胞壁外膜相连。Hp菌形为弧形、D型或海鸥展翅状，革兰染色阴性，碱性复红单染效果较好。尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶反应性阳性。微氧条件下生长，在血平皿上及含10%小牛血清的布氏肉汤中生长良好。195份Hp培养阳性的胃粘膜标本中，4h尿素酶快诊的阳性检出率为84.6%，特异性为100%。直接涂片镜检能查出较为典型的Hp菌，阳性检出率为87.5%。因此，这两种方法对于Hp菌的快诊都具有重要的意义。为了配合临床的诊断粘膜标本应尽快送检。但如送检条件受限，标本可保存在含10%小牛血清的布氏肉汤液体保护中。在4°C冰箱中，Hp一般可存活1W左右，最长者可存活17d。更好的保护液有待进一步研究。由于Hp的存活、传代保存问题尚未解决，致使各实验室出现不尽一致的结果，所以需要有一个适合于Hp菌生长的统一的阳性对照，如培养基中加入血清、活性炭、玉米淀粉、猪胃粘蛋白、甲基纤维素的mlueller-hinton琼脂、布氏琼脂、胰酶消化大豆琼脂等等，以适合于Hp生长、吸收或抑制毒性因子。
目前，国内外对Hp的研究尚处初期阶段，多数学者认为Hp与慢性活动性胃炎和消化性溃疡有关，用敏感的抗生素及TDB治疗，随着病变的恢复，Hp消失，溃疡的复发率也随之降低。除应用一些敏感的抗生素之外，中草药的研究、治疗也不可忽视。
对Hp动物实验的研究，国外报道用无菌动物及悉生动物（SPF），主要有幼年小猪、水獭、雪貂及恒河猴等。国内探索用大白鼠研究胃炎及溃疡的动物模型，观察Hp感染组与非感染组的不同药物疗效。我们实验室用不同种的小白鼠进行Hp感染，没能形成明显的病理改变，推测其原因可能是受试动物对Hp不敏感而形成自身保护，Hp菌不能长期滞留胃内，对胃粘膜不能构成威胁。因此，为了研究Hp的毒力，致病性，为了研制一种疗效高、副作用小的中、西药物，一种适宜的动物模型是非常重要的。

自1983年澳大利亚的Warran和Matshall从慢性活动性胃炎病人胃粘膜活检标本中找到幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）后，先后已有英国、荷兰、德国、美国、加拿大、日本、秘鲁及我国从慢性胃炎和消化性溃疡等病人中分离到此菌。这此些报道普遍反映了胃粘膜中Hp检出与慢性胃炎、消化性溃疡的存在两者之间有高度的相关性。Matshall(1985)和Morris(1987)先后还用Hp作自身感染实验，均证明能引起急慢性胃炎，Morris并观察到能发展成慢性胃炎，这进一步证实了Hp对人类胃粘膜致病的可能性。但Hp如何致病？Hp是否属于弯曲菌属？目前仍存在着争议。为此，本文用透射和扫描电镜对Hp形态结构及其与胃粘膜上皮的关系进行了观察，旨在为阐明Hp的生物学地位及致病性提供某些线索。
1 材料和方法
1.1 活检标本及菌种
33例活检标本采自经内窥镜诊断为浅表性或萎缩性胃炎患者近幽门部位的胃粘膜。Hp菌种31株，从慢性胃炎或消化性溃疡患者胃粘膜活检中分离而得。空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni,CJ）菌株：CJ（CF-1）由上海市卫生防疫站提供：CJ（82-56）由苏州医学院生物学教研室提供。胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus,CF）及结肠弯曲菌（Campylobactercoli,CC）菌种各两株，其中CF（GIFu 8735）及CC（GIFU 8733）由日本大阪大学三轮各俊夫教授提供，另有CF及CC各一株由法国巴黎第五大学Berche教授提供。
1.2 电镜检查
1.2.1 透射电镜标本制备活检标本在含2.0%戊二醛的二甲砷酸钠缓冲液（pH7.3）中固定2h～4h，二甲砷酸钠缓冲液洗2次后在1%四氧化锇中作后固定、包埋、超薄切片。菌株超切片标本取自血平板上培养2d～3d的菌落。无菌生理盐水轻轻洗下，3000r/min20min离心沉淀，弃上清，以无菌生理盐水重复洗涤一次后，取沉淀作透射电镜标本制备，方法同上。
细菌悬滴标本制备：于清洁蜡块上滴一滴新鲜培养的细菌悬液，以喷涂炭膜的铜网覆盖其上，静止15min，取下铜网，用滤纸吸去残剩液体。再覆盖在一滴20%的磷钨酸上负染15min，取下铜网，吸去残剩液体，自然干燥后待检。上述各标本在日立-500电镜下观察。
1.2.2 扫描电镜标本制备活检标本（用生理盐水洗去表面杂菌及粘液）在戊二醛二甲砷酸钠固定液中固定2h～3h，经二甲砷酸钠缓冲液洗2次后，直接在乙醇中作梯度脱水，然后移入100%醋酸异戊酯，在临界点下干燥，真空涂金。菌落标本制备：取经2d～3d培养的Hp血平板，选择菌落生长良好区域，节下约1cm2琼脂块，轻轻浸入上述电镜标本固定注中固定。随后制备步骤同上。上述标本均在JEOlJSM-840扫描电镜下观察。
2 结果
2.1 Hp的形态结构从不同病人胃粘膜上分离得Hp的形态结构基本一致，呈“S”形弯曲、弧形或稍直，偶见分支状。一般表面较光滑，末端或二端（多数为一端）具有2～6条鞭毛，长度稍长于菌体。鞭毛外均有明显的鞘，带鞘的鞭毛直径约50nm的圆球状结构相连。菌体末端鞭毛基础结构内侧，有一宽达200nm～400nm的电子密度明显降低区域，其底部无明显的细胞膜结构为界。在光滑的菌体表面有进呈现大小较均匀、排列整齐的突起。在参考菌株中，CJ与CC末端呈圆锥体样，稍尖，顶端明显地呈吸盘样结构。GF亦见较小的吸盘样凹陷。CF，CC，CF均有单根无鞘端鞭毛从顶端的吸盘样凹陷中伸出。根部均未见圆球体状基础，CJ与CC均未见电子密度明显降低区域。
2.2 Hp与胃粘膜上皮的关系活检标本包括胃粘膜及其表面的粘液两部分。一般情况下，胃粘膜上皮与粘液层间不存在细菌。若出现细菌，常为大小、形态都呈弯曲样特征的菌群。多聚居在胃小凹的细胞与细胞间连接处部位。偶然尚可见Hp存在于壁细胞的分泌小管中。Hp与粘膜上皮细胞间保持一定的间距，借众多的细丝状网状结构使两者互相粘附。另一种是细菌的部分细胞壁与上皮细胞的细膜膜直接相贴粘附，二者间几无间距。以前者较为多见，有时在同一细菌可出现两种粘附现象。在粘膜上皮表面有Hp粘附的区域附近，往往有炎性细胞的浸润和渗出。Hp粘附处的上皮细胞除微绒毛明显减少或消失外，很少发现有明显的细胞病理学变化。胃粘膜上皮细胞中偶见对Hp吞噬现象。粘膜上厂表面的粘液层分不溶性粘液与可溶性粘液两部分。正常情况下不溶性粘液层为包裹在粘膜上皮表面的连续层，可溶性粘液为其周围的流动滋润层。在超薄切片下，出现Hp的标本中，Hp在不溶性粘液层中大致呈散在的分布状态，且大多呈同方向排列。不溶性粘液中的Hp主要呈横断面，而在其外侧的可溶性粘液层中则随意排列，还可见到纵断面、横断面甚至斜断面等不同的切面。经用无菌生理盐水充分冲洗的活检标本，在扫描电镜下可见Hp不规则地粘附在不溶性粘液层表面。
3 讨论
目前弯曲菌属的分类，主要根据光镜下的形态特征、培养特性、生化反应及其DNA的G加C百分比含量等。这些性质与螺菌族中其他细菌有很多交叉，以致造成对Hp归属的意见不一。我们用透射电镜和扫描电镜进行了形态结构的观察，并参考有关文献，发现Hp与CJ，CC，CF在鞭毛源出部位，数量及结构等方面存在着明显的不同。例如，Hp与CJ，CC，CF均有端鞭毛。我们从Hp中看到每一根鞭毛有一只镶嵌在细胞膜和细胞壁中的，圆球体为基础，其内侧尚有一明显的电子密度降低区。而其他弯曲菌属细菌却未找到此结构，仅CF亦见有电子密度降低区。由此可见Hp鞭毛及共结构的特征与弯曲菌属其他细菌有所不同。而Hp的末端钝圆等与水螺菌中的一个种（Aquaspirillum serpens,AS）却相似，因此有人认为它很可能属水螺菌属。Hp与弯曲菌属其他细菌间的区别除了鞭毛及其有关结构外，Hp能分解尿素，而其他主要的弯曲菌属细菌均不分解尿素，亦是一重要特征。另外还在分类学上有重要意义的菌体脂肪酸组成、16rRNAHp的部分核苷酸顺序分析、菌体蛋白质电泳图谱方面Hp与弯曲菌属的主要代表菌种之间都有明显差别。因此Hp是否应属弯曲菌，还值得商榷。
Hp致病机理，虽然有 Marshall和Morris等作了自身感染实验，但它的具体致病机理仍然缺少解释。从我们在电镜下观察，Hp进入机体后侵入的途径很可能是：Hp首先粘附在不溶性粘液层表面，然后藉其螺旋状菌体特征及特殊的鞭毛运动方式迅速钻入不溶性粘液层中间，继而与粘膜上皮细胞接触，并大多在胃小凹及粘膜上皮细胞连接处粘附定居。胃中寄生菌虽然不多，但过路菌是很杂的，且胃酸比较强，粘膜表面有不溶性粘液层作屏障，胃粘膜上皮及其分泌的粘液代谢又很快，为什么仅有Hp能在胃粘膜上寄生？这一方面可能由于Hp螺旋状的菌体特征和它鞭毛的特殊运动方式，促使它比一般肠道杆菌更容易穿透不溶性粘液层。由于不溶性粘液的分子结构呈索条状，当Hp钻入其间时，易呈相对平行状态，这与光镜下所见Hp在粘液中呈鱼贯状分布相符。另一方面可能由于Hp对粘膜上皮细胞有特殊的亲和结构。正如我们所观察到的那两种粘附现象，它们很可能在这中间起着重要的决定作用。这种特异性粘附现象从胃的肠化生组织找不到Hp，在肠的胃脂有利于组织却能找到，从而间接得到了证明。这种有高度特异的亲和机制促使Hp能克服胃粘膜上皮的不断代谢更新过程，而继续在新生的粘膜上皮上定居寄生。然后可能再通过其生产的细胞毒素及尿素酶直接和间接作用，造成胃粘膜上皮的局部病损。
Hp表面出现有规则的突起、在CF、AS中已有报道，Kist认为是菌体外膜蛋白层的组成部分，而Winter认为是微荚膜。光镜下所见Hp的微荚膜样结构可能就属之。McCoy认为这类结构具有抗吞噬作用。但我们将Hp加入新鲜抗凝人血作吞噬实验，发现Hp很容易被吞噬。这亦可使胃上皮细胞对其有吞噬作用得到解释。从目前观察到的慢性胃炎病人胃粘膜活检中出现的一些主要特异性组织病理学表现，例如炎性细胞的浸润和渗出等，很可能是因Hp在胃粘膜上皮细胞上粘附或被上皮细胞及炎性细胞吞噬后释放的趋化因子所引起，至于Hp是否有其他致病因子，尚待进一步研究。

幽门螺杆菌是近年来从人体胃组织中发现的一种细菌，与胃和胃溃疡的发生有密切关系，而空肠弯曲菌则是近十年来国内外学者较为注意的腹泻致病菌，这两种细菌营养要求及培养条件均较高，特别在菌株保存方面，至今还存在不少问题，为了更好地开展这些疾病的基础研究，我们对不同种类的弯曲菌，在20%小牛血清布氏肉汤和全羊血中保存，于不同时间检查了存活情况、生物学特性及染色体DNA的酶切图谱，实验证明，用这种方法保存，在存活率、菌体形态、生物特性保持较好，染色体DNA酶切带型前后保持一致。 1 材料和方法 1.1 菌株 幽门螺杆菌自各型胃病患者的胃粘膜中分离，共15株。空肠弯曲菌由国内不同地区分离，共34株（其中人源菌11株，鸡源菌8株，鸭源菌6株，鹅源菌4株、猪源菌2株、羊源菌3株），另外从比利时引进空肠弯曲菌3株（Cj22，32，26），结肠弯曲菌2株（Cc25，29）及海鸥弯曲菌3株（Cl34，35，36）和分子量测定用经过HindⅢ酶解的标准γ噬菌体DNA。 1.2培养基 试验用培养基用改良布氏琼脂及布氏肉汤均按参考文献配制。 1.3 染色体DNA提取 弯曲菌经37°C48h在混合气体（10%CO2，5%O2，85%N2）条件下培养，每个平皿20mlT.E洗菌，置30ml的离心管，经5000rpm/分离心10min，弃上清，沉淀用10mlT.E悬浮，加10%SDS1.5ml于65°C水浴中1h；用酚抽提3次，酚/氯仿异戊醇抽提5次以上，再用氯仿抽提2次；然后透析）T.Hp8.0)24h以上，换T.E4次，用玻棒缠绕经异丙醇沉淀的DNA，再用75%乙醇浸泡2次，每次10min，将坡棒倒插，DNA向上，室温中凉干；用800μlT.E将玻棒上的DNA洗入小离心管中，于-20°C中保存。 1.4 弯曲菌染色体DNA酶切 用PstⅠ,HindⅢ E.coRI,Bg1Ⅱ,XbaⅠ五种酶进行试验，各种酶均购自中国医学科学院基础医学研究所。 2 结果 2.1 过氧化氢酶阳性弯曲菌的生物学特性 对于-70°C条件下保存不同时间的弯曲菌主要生物学生物学特性：生长温度，1%甘氨酸的生长，对萘啶酮酸敏感性，尿素酶活必以及马尿酸水解，进行了检查与比较，基本特性与初分离时相同，其结果见表1。 表1 过氧化氢酶阳性弯曲菌经-70°C保存后生物学特性

菌株	生长温度			1%甘氨酸生长	对萘啶酮酸抗性	尿素酶试验	马尿酸水解
	25℃	37℃	43℃
幽门螺杆菌	－	+	－	+	－	+	－
空肠弯曲菌	－	+	+	+	－	―	+
结肠弯曲菌	－	+	+	+	－	―	－
海鸥弯曲菌	－	+	+	+	+	―	―

以上结果表明在-70C条件下保存，弯曲菌复苏快，性状稳定。 2.2 弯曲菌于低温（-70°C）条件下存活检查 各种弯曲菌在布氏血琼脂中，经10代以目上传代稳定后，一般在混合气体条件下，于37°C经24h～48h培养后，均能见到较为丰富的生长，经涂片作0.3%复红单染色，镜检一般均能见到生长典型的弯曲菌，然后用Eppendorff离心管加1ml20%小牛血清布氏肉汤（或全羊血），将培养物用白金耳直接刮到小管内，形成浓厚的菌液，以后将小管在-20°C中预冻，次日再保存在-70°C中，经不同时间检查存活情况，结果如表2。可见在3～10个月内于-70°C条件下，全部存活，以上保存方法简便，易行，可作为弯曲菌保存。 表2 各种弯曲菌经-70°C低温保存后检查

菌株		存活情况							菌形检查
		7D	15D	1月	2月	3月	6月	10月
人源株		11/11	11/11	11/11	11/11	11/11	11/11	11/11	典型海鸥翅样或弧形弯曲菌，极少数作球状
C.jejuni鸡		8/8	8/8	8/8	8/8	8/8	8/8	8/8
空肠鸭		6/6	6/6	6/6	6/6	6/6	6/6	6/6
弯曲菌鹅		4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4
猪		2/2	2/2	2/2	2/2	2/2	2/2	2/2
羊		3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
H.pylori胃炎及幽门弯曲菌溃疡病患者		15/15	15/15	15/15	15/15	15/15			经分离传代可见40%～95%典型弯曲菌，有的作小球状
对照组	空肠弯曲菌	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	菌形较典型的弯曲状
	结肠弯曲菌	2/2	2/2	2/2	2/2	2/2	2/2	2/2
	C.coli
	海鸥弯曲菌	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
	C.laridis

2.3 经传代冷冻保存后，弯曲菌染色体DNA酶切图谱检测 2.3.1 空肠弯曲菌染色体DNA酶切 实验分两步进行 ①取空肠弯曲菌E3、E4（鹅源菌），G891（鸡源菌），流羊27（羊源菌）的染色体DNA，分别用三种内切酶进行消解（HindⅢ、PstⅠXbaⅠ）各管于37°C水浴中，作用1.5h，然后进行电泳，电泳在稳压下进行，电压为50V，电泳完毕后将琼脂糖凝胶（E.B加在凝胶中）置紫外灯下观察，并照像。②经初步试验后，又取适宜的PstⅠ进行消解，获得前后对比较好的结果。 2.3.2 幽门螺杆菌染色体DNA酶切 幽门螺杆菌自三种不同胃病患者的胃粘膜中分离，Cp397（慢性胃炎、溃疡病），Cp400（十二脂肠球溃疡），Cp407（浅表萎缩性胃炎），提取染色体DNA后，用Bg1Ⅱ进行酶解，各管于37°C水浴中，作用2.5h电泳40V.2h后30V17h，电泳后将琼脂糖凝胶（E.B加在凝胶中）置紫外灯下观察照像。可以看出用HindⅢPstⅠey XbaⅠ对不同弯曲菌酶切图谱有所不同，但其中以PstⅠ酶切的带型较清晰，还可看到四株不同来源的空肠弯曲菌及三株幽门螺杆菌，在较为长期保存后，染色体DNA酶切图谱带型完全一致。 3 讨论 弯曲菌菌种保存，对于深入开展对本菌的研究，有着非常重要的意义，文献上介绍的方法不多，幽门螺杆菌用全血或加20%小牛血清布氏汤或加入各种添加剂进行保存，但时间均不太长，Drum等用10%小牛血清布氏汤液体培养物，经24h培养后，添加50%甘油及小牛血清，于-70°C中能存活6个月；空肠弯曲菌用50%卵黄盐水，使用时，接种一白金耳菌苔，置微氧罐内，增殖24h，换上橡皮塞，置35°C温箱中，可保存5个月之久，在布氏肉汤内于-20°C中可存活2个月；15%甘油布氏肉汤中，在-70°C中可存活半年，但以上方法所保存的菌株，均不能获得完全存活；而我们所用的10%的小牛血清布氏肉汤，将24h～48h的新鲜菌苔，直接刮到保存的Eppendorff离心小管中，每管加培养基1ml，不需重新培养，可直接置-20°C中预冻，过夜后，再于-70°C中作长期保存，细菌染色体DNA限制性内切酶分析，可应用于流行病学调查及菌型的鉴定，同型的菌株应该有完全相同的染色体DNA酶谱；实验证明经这种方法对弯曲菌保存后、其生物学特性及染色体DNA酶切图谱的检查，均获得性状的前后一致，因此，这是一种比较简易可行的保藏方法，但对更为长期的保存，仍需作进一步的研究

为研究和证实十二指肠胃上皮化生(GM）与幽门螺杆菌及（Hp）十二指肠溃疡的发生之间关系作者进行了如下超显微结构的观察，现报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 均为我院内镜检查的患者，内镜检查结合病理切片观察严格选材，18例球部标本，其中十二指肠溃（DU）13例，慢性十二指肠炎3例，正常十二指肠2例；1例窦部标本（有活动性炎质）作透射电镜观察，8例球部标本，包括DU5例，慢性十二指肠炎2例，正常十二指肠1例作扫描电镜观察。球部标本一块放入4%戊二醛固定液内做电镜观察，另一块放入10%福尔马林液固定，作组织化学染色。 1.2 方法 1.2.2 透射电镜观察 采用日立牌H700型透射电镜。标本常规在4%戊醛内固定和在1%四氧化锇（OsO4）的1h后脱水，包埋，先制备1μm厚的半薄切片，1%NaOH溶于酒精作软化剂，软化树脂20min至1h，常规HE染色后在光镜下定位，制500nm超薄切片，醋酯双氧钠，柠檬酸铝双染色后电镜观察。 1.2.2 扫描电镜观察 为上述透射电镜之扫描附件。固定同上；丙酮梯度脱水；醋酸异戊脂置换；CO2临界点干燥；立体显微镜下定位；离子喷镀仪镀铂后观察。 1.2.3 复染色方法 将数块活检标本放入盛有1～2ml生理盐水的无菌试管内，以3000转/分 转速离心后取悬液，用Formvar-碳沫酮附上述悬液2min,1%～2%磷钨酸水溶液（pH6.5～7.4）染色1min～2min后，立即在透射电镜下观察。 2 结果 用AB（pH2.5）/PAS染色，根据十二指肠绒毛上皮形态，分化程度将其分为正常、胃上皮化生（Ⅰ型-分ⅠA和ⅠB两亚型和不表现明显上皮化生（Ⅱ型无奇不有类，见表1。 A表现为绒毛萎缩、粘膜表面呈波浪状，粘膜表层上皮完全由化生的胃表面粘液细胞（即GMC）组成。GMC胞浆内含大量的PAS阳性物质，化生区无杯状细胞（图略）。18例DU有6例呈ⅠA表现，内镜下大多有明显溃疡灶，边缘有瘢痕组织形成，底部无明显苔膜覆盖，甚至溃疡被瘢痕组织填平（即H期和S期）。ⅠB型表现为绒毛形状在萎缩到正常之间，可见正常杯状细胞和吸收细胞点缀在GGM之间，GMC胸浆内只有少量的PAS阳性物质（图略）。10例DU和2例慢性十二指肠炎表现为ⅠB型改变，内镜下表现有明显溃疡灶及周边明显充血、水肿，底部有较厚的苔膜覆盖（即A期）。Ⅱ型表现为杯状细胞、吸收细胞和绒毛形状正常，在吸收细胞胸浆内见PAS阳性小滴，杯状细胞数量可轻度增加。2例DU表现为Ⅱ型改变，内镜下表现粘膜明显充血、水肿和渗出及浅表溃疡的形成，为溃疡早期阶段。3例内镜下正常十二指肠粘膜组织学上亦正常。 表1 DU边缘粘膜表面形态学分型

分 型	绒毛形状	GMC	吸收细胞	杯状细胞
Ⅰ型ⅠA	萎缩或粘膜表面呈波浪状	PAS阳性物质个别含少量	无	无
ⅠB	萎缩到正常	含少量PAS阳性物质	可见正常吸收C	可见
Ⅱ型	正常	无GMC	含少量PAS阳性物质滴	轻度增加

△GMC：the metapiastic gastric surface mucus secreting cells 透射电镜观察，正常杯状细胞游离面是由大量指状微绒毛密集平行排列形成纹状缘，微绒毛表面覆以质膜及分支状多糖-蛋白质复全物（glycocaluyx,GX），胞质内含有各种细胞器，如丰富的滑面内质网，许多粗面内质网，发达的高尔基复合体以及线粒体和溶酶体，胸质内无粘原颗粒。光镜下表现为Ⅱ型的吸收细胞表面策绒毛排列紊乱、断裂，相邻微绒毛互相融合增宽，有时微绒毛受侵，在质膜下仅见一个完整的微绒毛核心，微绒毛外层的多糖-蛋白质复合物中断、变薄甚至消失。胸浆内无明显粘原颗粒，细胞器形态及排列正常；ⅠB型的吸收细胞除表现为上述微绒毛改变外，胞浆内见大小不等，分布不均和电子密度不同的粘原颗粒。细胞器萎缩，消失或被挤压在胸浆两侧。在GMC之间可见到正常的杯状细胞；ⅠA型吸收细胞除表现ⅠB型外，胞浆内粘原颗粒更为密集、丰富，有时在细胞表面可见到粘液层。GMC形态与胃表面粘液柱门面细胞相似；扫描电镜观察，GM区表面绒毛萎缩，紊乱甚至平坦，表面粗糙呈颗粒状。 3例DU边缘粘膜组织和1例窦部组织光镜下和电镜下发现Hp。透射电镜下，球部及窦部所见Hp形态特征相似，胞壁具有双层膜结构，在两层膜间常见局部加宽，在菌体一端可见1～4条有鞘鞭毛，有时可见箍缩分裂相。Hp均局限在胃上皮化生区，与GMC膜间常以垂直方向的丝状物相连，此丝状物附着处及其附近微绒毛断裂、消失或增宽，菌体周围组织被溶解，并可见游离的细胞碎片、粘膜破坏，失去连续性等现象（图略）。两例DU边缘活检组织复染样本中，1例检出Hp，其形态特征与窦部检出的Hp相似。 3 讨论 十二指肠胃上皮化生（GM）是指十二指肠粘膜，特别是球部膜出现了胃粘膜表层粘液柱状上皮细胞，化生区上皮细胞PAS反应阳性。本文结果提示，GM主要发生在有明显炎症的球部，特点常见于DU边缘部，正常十二指肠球部和十二指肠降段粘膜很少见。本文认为，GM是DU的组织学特征，组织形态上表现为ⅠA、ⅠB和Ⅱ型的改变是粘膜表面上皮在向胃上皮化生过程中分化程度不同的结果，因而能客观地反映溃疡的进展程度和愈合程度。即Ⅱ型为粘膜遭受损害后溃疡形成的早期阶段；ⅠA型为溃疡周围陈旧的具有保护作用的愈合阶段；而ⅠB型为介于Ⅱ型和ⅠA型溃疡愈合过程中的中间阶段，与Greogery的结果一致。部分无明显溃疡灶但有GM发生的十二指肠炎实际是DUⅡ型或ⅠB型阶段，性质不同于慢性十二指肠炎，治疗应按DU治疗。 Patrick等的研究发现，十二指肠粘膜上皮的形态学改变（即GM）更容易发生在胃酸过多的病人中，即胃酸和GM的发生有关。本文结果显示，十二指肠内的幽门螺杆菌和胃窦部中的幽门螺杆菌形态特征相似，与冯瑞娥等用透射电镜观察到的Hp和胃粘膜上皮细胞间的连接方式和细菌的形态特征相同。Hp通过特殊的丝状物与GM细胞相连，并观察到Hp可损害十二指肠粘膜，可能是直接或是其分泌的蛋白水解酶等作用的结果。认为Hp是DU的致病细菌，同时发现组织学上有GM的DU并非均有Hp感染，说明Hp仅仅是引起DU的原因之一，DU发病的原因是胃酸和Hp共同作用的结果，即在胃酸的作用下，十二指肠发生胃上皮化生为Hp提供了感染条件，Hp的感染可能加速了溃疡的形成，并可能影响溃疡的愈合和预后。因此，对DU的治疗应该是以抑制胃酸分泌和中和胃酸为主，辅以抗菌药物治疗，可以达到促进溃疡愈合和预防复发和目的。

幽门螺杆菌（Hp）感染在人群中广泛存在，Hp的分型鉴定对其感染的临床及流行病学研究具有重要意义。国外文献报道的几种基因型技术使Hp的分型鉴定成为可能，而PCR及单链构象多态性（Signle-strand conformationpolymorphisms,SSCP）分析在菌株分型鉴定中的应用则尚未见报道。作者采用PCR-SSCP分析区分不同来源的Hp，并探讨其应用价值。 1 材料和方法 1.1 菌株来源 Hp标准菌株NCTC11637，NCTC11848来自英国伦敦国家标准培养物收藏中心，由本院传染科保存并提供；112株临床分离鉴定的Hp来自97名因上胃肠症状在本院行胃镜检查的病人，经内镜及病理诊断证实十二指肠溃疡49例，胃溃疡5例，慢性胃炎43例。所有病人在内镜直视下于胃窦取粘膜活组织一块做细菌培养，其中包括1例未经治疗相融8个月复查胃镜者，4名病人还另于胃底或十二指肠球部取粘膜活组织一块做细菌培养，10例十二指肠溃疡伴Hp感染者于抗生素治疗停药4周复查胃镜，取胃窦粘膜活组织两块分别做细菌培养及PCR方法直接检测Hp。 1.2 模板DNA的准备培养细菌或研碎的活检胃粘膜以1%SDS100μg/ml蛋白酶k，55°C消化1h，以等体积苯本分氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提，12000rpm离心10，吸取上层水相，加2.5倍体积冷无水乙醇12，000rpm离心10min沉淀DNA，以100μl无离子溶解DNA，1μl用于PCR扩增。 1.3 PCR扩增Hp基因组 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’，已证实对HpDNA特异，扩增片段长度为203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mMMgcl2,0.01%明胶，各200μdNTP，各0.5μMCAM-2/CAM-4引物，1.25U TaqDNA聚合酶（中科院遗传所产品）。反应条件：94°C5min,1个循环；94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35个循环；72°C10min，1个循环。以HpNCTC11637DNA为阳性对照，去离子水做阴性对照。 1.4 PCR产物的SSCP分析 PCR产物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C变性10min,加3μl电泳加样缓冲液（95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯腈蓝）混匀，于7.5%聚丙烯酰胺胶室温电泳300V，3.5min，以0.19%硝酸银染色30min，经显色液（1.5%NaOH,0.5%甲醛，0.0085%硼氰化钠）显色后观察结果，比较不同Hp菌株两条单链DNA片段的迁移情况。 2 结果 2.1 PCR-SSCP方法的重复性 相隔半年转种得到5对Hp菌株，每对菌株203bpPCR产物的SSCP分析均显示完全相同的单链构象；同一菌株203bp PCR产物在不同聚丙烯酰胺胶上都呈现相同的单链构象，使不同凝胶上菌株的PCR-SSCP分析具有可靠性。 2.2 Hp基因组DNA203bp片段SSCP分析 不同Hp菌株203bp片段变性后的两条单链，在中性聚丙烯酰胺胶中电泳的迁移率不同，从而形成不同的单链构象。来自97名病人的分离菌株及2株标准菌株产生7种不同的单链构象。通过比较不同的单链构象。通过比较不同Hp菌株的单链构象，将这97名病人的菌株分成6组（见表1）。同一病人相隔8个月分离培养的菌株，其203bpPCR产物的单链构象稳定不变；4个病人不同培养部位的4对Hp菌株分别具有相同的单链构象。 表1 Hp标准菌株来自97名病人的临床分离菌株的分组情况

组别	菌 株 来 源				菌株总数	总百分数（%）
	十二指肠溃疡	胃溃疡	慢性溃疡	标准菌株
1	32	5	35	1	73	73．74
2	10	0	6	0	161	6．16
3	3	0	1	0	4	4．04
4	2	0	1	0	3	3．03
5	1	0	0	0	1	1．01
6	1	0	0	0	1	1．01
7	0	0	0	1	1	1．01

2.3 治疗前后菌株的PCR-SSCP分析10例Hp感染者抗生素治疗后停药1月或1月以上复查，发现6例细菌培养仍为阳性，4例细菌培养阴性而PCR检测仍为阳性。对这10例病人治疗前后菌株的PCR-SSCP分析，发现9例病人治疗前后的菌株具有相同的单链构象，1例病人治疗前后的单链构象不同。对其中2例治疗后仅PCR为阳性的患者，于停药5个月～6个月复查时发现细菌培养转为阳性，并与治疗前菌株具有相同的单链构象（表2） 表2 10例Hp感染者治疗前后菌株的PCR-SSCP分析

临床诊断*	停药间隔	菌株**	PCR-SSCP分组
DU		93060B	1
	4周	9367a	1
	5个月	94123A	1
DU		93018B	1
	4周	9385a	1
NUD		93035B	2
	4个月	93104A	1
GU		93077B	1
	4周	9348A	1
	6个月	94124A	1
DU		93026B	1
	4周	93046A	1
NUD		93020B	3
	4周	93036A	3
DU		93028B	4
	6周	93055A	4
DU		93086B	1
	4周	94114A	1
DU		93089B	1
	4周	9392a	1
DU		93017B	2
	4周	93032A	2

**B-治疗前菌株；A-治疗后菌株；a-治疗后仅PCR阳性 表2中同时列出不同组别菌株的疾病来源，未发现不同组别的菌株与某一疾病有确定的关系，未发现与十二指肠溃疡或胃溃疡密切相关的Hp菌株。 3 讨论 不同Hp菌株DNA分子具有多态性，PCR-SSCP分析作为检测DNA多态及基因突变的方法，有可能检出这一多态性，从而区分不同来源的Hp菌株。本研究用PCR-SSCP分析鉴别不同Hp菌株方法简单、可靠、重复性好，通过比较97名病人的临床分离菌株及2株标准菌株基因组DNA203bp片段的两条单链DNA，在聚丙烯酰胺胶中的电泳迁移率，将这些被检菌株分成7组，表现出中等度的分辨力。它虽然不能将所有不同病人来源的菌株逐一区分，但可对流行病学上某特定人群的菌株分组从而可以比较不同人群中感染的Hp有无差异。 本研究中显示74%的菌株具有相同的单链构象，推测可能是北京市区人群Hp感染的主要菌型。本结果还证实同一病人相隔8个月分离的菌株，其203bp片段的单链构象稳定不变，这与文献中报道的同一病人2年内连续分离的多株Hp，其染色体DNA酶切图型保持不变的结果相似。对来自4名病人不同部位的4对Hp菌株的PCR-SSCP分析，未发现同一病人有不同类型Hp菌株的混合感染。Petwett等用Southern印迹法对来自15个病人的胃窦、胃体及十二指肠球部的64株Hp核糖型分析，发现2个病人分别感染了两株不同的Hp。本文观察的病人数不多，尚难做结论。 对10名病人治疗前后菌株的PCR-SSCP分析，发现9名病人治疗前后的菌株具有相同的单链构象，认为是治疗后同一菌株的复发。1名病人治疗前后的菌株单链构象不同，可能是治疗后获得了新菌株的再感染，或药物治疗导致原来感染的菌株变异但也不排除两株不同类型Hp菌株混合感染的可能。PCR-SSCP分析用于治疗后Hp复发和再感染的鉴别与文献报道相类似，但由于不同Hp菌株也可有相同的SSCP图型，使该方法对治疗前后菌株的鉴定不够精确，进一步研究可通过选择扩增DNA多态性更为显著的片段，或许可以对治疗前后菌株复发及再感染做出更精确的判断。PCR-SSCP方法用于治疗前后菌株的鉴定，可以从活检胃粘膜中直接增出DNA片段用于SSCP分析，省却了细菌培养的繁琐耗时的过程，特别适用于那些治疗后细菌培养无法检出，而实际上仍然少量存在的Hp菌株的鉴定，这是其它菌相提并论鉴定方法难以达到的。研究表明，Hp存在着致病力不同的两组菌株，它们致病力的不同表现在与不同的病症的关系上。Tee等用Southern印迹法对Hp核糖带型的研究，未发现Hp的核糖型或核糖型的某条带与临床疾病有对应关系、Yoshimara等用DNA-DNA杂交技术证实，十二指肠溃疡和无症状胃炎病人感染的Hp有明显的遗传学差别。本研究对不同Hp菌株基因组DNA203bp片段的SSCP分析，未发现与临床某一疾病相关的细菌DNA单链构象，可能由于该片段编码的信息与Hp的致病力无关，对Hp毒素相关基因的分析或许可以发现与不同疾病表现相关的菌株，有待今后进一步研究。