3．幽门螺杆菌的免疫学研究

自从Warren和Mashall从人胃粘膜中分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pyloi,Hp）以来，国内外大量的研究资料表明它与非自身免疫性慢性胃炎和十二指肠溃疡病关系密切。对该菌的免疫学研究也已有不少进展，这对弄清其致病机制、诊断和治疗均有重要意义。我们仅就近年来国外对Hp的免疫学研究现状作一综述。

Hp做为一种致病菌，可引起人体特异性和非特异性免疫反应。Wyatt等应用免疫过氧化物酶染色法研究了非溃疡性消化不良病人Hp感染时的局部免疫反应，在所有活动性胃炎病人及部分非活动性胃炎病人均可见细菌被IgA包裹，并且发现IgG和IgM包裹和胃炎的活动性有关。被包裹的细菌多位于粘膜表面，位于胃小凹深部的有些细菌则未被包裹，从而提示这一部位的细菌可以保存下来，免受抗体的伤害。
Kazi等用免疫过氧化物酶染色法对53块胃窦活检标本进行了细胞和体液免疫反应的研究，发现Hp相关性胃炎与无菌的慢性胃炎和正常对照间有明显差异。IgA、分泌成分和补体C3包裹的细菌可见于所有慢性活动性胃炎病人。C3总是与IgA、IgM或两者共同包裹有关，这种现象罕见于没有中性多形核粒细胞浸润的病人，在26例Hp相关性慢性胃炎中，有18例出现上皮内单个核细胞浸润。这些上皮内单个核细胞对T淋巴细胞和组织细胞染色阳性。研究结果提示Hp相关性慢性胃炎时的细胞和体液免疫均显著增强。
Attar等用免疫组化技术研究了21例胃炎的胃粘膜活检标本，发现Hp阳性胃炎组的总T细胞和抑制性T细胞出现例数的比率显著高于该菌阴性组；辅助性T细胞的检出率、自然杀伤细胞的存在与否和B细胞的分布在2组间无差异；粘膜中的IgA，IgG，IgM浆细胞出现于所有病人，但3种产生免疫球蛋白的浆细胞有较高的密度在Hp阳性胃炎则高于阴性者。研究表明有Hp阳性胃炎胃粘膜中浆细胞有较高的密度，且炎症主要是由于过多存在的总T细胞尤其是抑制T细胞所介导，结果提示：Hp在胃粘膜中既引起体液免疫反应，又引起细胞免疫反应。
Das等比较了不同来源的人血清对Hp的调理素活性， 发现不论是没有胃炎或消化性溃疡病症状的对照组或是分离出或未分离出Hp的有症状病人的血清，对Hp有同样好的调理素作用。同时发现调理素作用取决于补体激活的旁路途径而不取决于抗体。上述发现提示：特异性抗体并无防御Hp的作用，血清中抗体仅具有诊断价值。
Bernatowska等用化学荧光系统和电镜检查法研究了三种不同弯曲菌和Hp对中性粒细胞的调理素作用，发现胎儿弯曲菌、结肠弯曲菌和空肠弯曲菌的调理素作用是由抗体介导，由补体增强，而对Hp的吞噬作用则由于它能直接激活补体活化的经典途径而不需要抗体。我们认为这一不寻常的特性在Hp相关性胃炎和十二指肠溃疡的发病机理中可能起重要作用。

现有资料提示：Hp可能分泌有一种或多种可使细胞发生变性的细胞毒性因子，这在其致病机理中可能具重要作用。Cover和Blaser于1989年在Hp的肉汤培养上清液中发现一种能使培养细胞发生空泡变性的细胞毒素，并证明这个Mr132000的细胞毒素相关性蛋白在活体内可为Hp感染的病人所识别。他们推测这种蛋白质的表达可能在消化性溃疡病的发生机理中起重要作用。
Figura检验了77株Hp细胞毒素产生情况，其中24株来自消化性溃疡病（和慢性胃炎）病人，53株来自慢性胃炎但无溃疡的病人，前者有16株（66.6%）、后者亦有16株（30.1%）产生细胞毒素。两者间差异有显著性，提示该毒性物质在消化性溃疡病的发生上起着病因学作用。Morgan给3窝小猪分别口服2株产毒和1株非产毒的Hp，仅产毒株在胃粘膜中定居并出现炎症、粘液减少、细胞内空泡形成和免疫反应，Hp的细胞毒性因子可能是其致病的重要因素。

国外已有数篇Hp单克隆抗体研制成功的报道。Negrini等把从培养皿中分离的6株Hp混合后免疫小鼠，32d后将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3X63.Ag8.653融合，细胞融合悬液于96孔板上培养生长杂交瘤细胞集落，用整个Hp作靶细胞的间接ELISA法筛选抗体，共获得21株阳性单克隆抗体，其中以CB-26为最好。
研究证明单克隆抗体CB-26具有很强的特异性，它不与人红细胞、粒细胞、胃窦腺细胞和胃小凹细胞起反应，也不与非弯曲菌属的Gram阴性菌、甚至空肠、结肠和胎儿弯曲菌起反应。作者等还对60名经内镜检查的病人鉴定了单克隆抗体CB-26辨认胃粘膜刷片中Hp的能力。用间接过氧化物酶染色法在所有32名培养阳性病人中均观察到大量Hp，而在28名培养阴性的病人中也有8例观察到少量细菌，可能是这些病人的活检标本中细菌量过少，不足以培养出来的缘故。这些研究提示单克隆抗体CB-26可能在Hp的快速和特异性检出中具有较高的价值。

Hp是突出的特点之一是具有活性很高的尿素酶，有人认为它同该菌的致病性和耐酸能力有关，而尿素酶的分子结构则与其免疫学特性密切相关。
Hu和Mobley研究了尿素酶的分子结构，将经柱层析纯化的尿素酶进行分析，证明纯化的尿素酶所占Hp菌体粗提取物可溶性蛋白5.9%,Mr为550 000,由两个Mr分别为66000和29 500的亚单位组成,两者在分子中的比例约为1:1，6对这样的亚单位构成一个基本的酶分子。并推测Hp强大的尿素酶活力是由于大量的尿素酶分子作用的结果，而不是单一酶分子活性特别高。
N-末端分析显示29 500亚单位氨基酸顺序上同刀豆尿素酶亚单位的氨基末端以及奇异变形杆菌和摩氏摩根菌（Morganella morganii）尿素酶3个亚单位中最小者具有很高的相似性。66 000亚单位同奇异变形杆菌、摩氏摩根菌和产生气克雷白杆菌尿素酶3个亚单位中最大者具有相似的内顺序（氨基酸271～285）。再者，摩氏摩根菌和刀豆的尿素酶亚单位可被Hp66000亚单位的特异性抗血清所识别。从而表明至少有部分相同的抗原决定簇留在不同种系的尿素酶中。
目前国内外已有用粗制尿素酶提取物做ELISA的包被抗原检测血清中的Hp抗体。由于分子结构的相似性及存在相同的抗原决定簇，用尿素酶提取物作抗原在临床上诊断Hp感染，有可能同含有尿素酶的其他菌群发生交叉反应，如泌尿道菌群等。但这种交叉是否严重到影响临床诊断、以及交叉频度、范围等问题，尚有待进一步的研究。

自从发现Hp后，血清学诊断方法迅速出现，并不断得到改进。早期应用的是血凝法和补体结合法，目前应用较多的是ELISA法。更精确的蛋白印迹法虽然能查出多种多样的人体全身抗原抗体反应，但并不适于流行病学调查。
作为常规应用的抗原选择仍存在问题，理想的抗原应具备以下特点：①特异性强；②致免疫性高；③制备容易；④贮存稳定。早期的抗原制备如全菌超声粉碎抗原，由于含有多种抗原包括鞭毛蛋白，特异性差，可同其他菌种如空肠弯曲菌起反应。酸提抗原或超速离心全菌上清液是更纯化的制备，使ELISA的结果更可靠。
应用Hp特有的蛋白质如尿素酶作为测定的基础是另外一个可行的途径。其特异性虽好但蛋白印迹法显示在不同人对每一个别抗原有显著不同的反应，即对某一单一抗原试验并非所有人都反应强烈，这种测定较之应用大范围的多种抗原虽然特异性强，但敏感性低。因此血清学检测仍有待进一步研究和改进。

Clayton等于1989年首次在大肠杆菌内构建了Hp的DNA基因库。他们筛选出一株能同特异性抗血清反应的阳性克隆（γcp2）。该克隆的表达产物系Mr66 000的多肽片断。免疫印迹分析多肽能同特异性Hp抗血清反应。将该DNA提取物经内切酶分析显着该DNA尚含有一个17 000的DNA除编码Mr66000的蛋白外，尚可编码Mr31 000的蛋白质抗原。免疫印迹显示在大肠杆菌中表达的这些抗原同在Hp菌体的抗原具有相同的Mr，并存于所有Hp菌株内。点杂交和间接免疫荧光染色证实由这些多肽产生的抗血清仅同Hp反应。表达这些抗原的DNA经用32p标记显示仅能同Hp菌株杂交。用亲和纯化的尿素酶多克隆抗体的免疫印迹显示这些克隆的抗原是尿素酶分子的一部分，但并无尿素酶活性。
用上述DNA探针和重组DNA表达Hp特异性抗原对探知无法培养的Hp，如唾液、粪便中细菌，探讨其致病机理和血清学诊断会有较大帮助。一旦筛选出的DNA克隆能够表达出特异性强、致免疫性高的抗原后，将会在临床应用中发挥更大的作用。

幽门螺杆菌（Helicobacterpylorida, Hp）现被公认为是慢性胃炎（CG）及消化性溃疡（PU）的致病因素之一。测定血清Hp抗体方法简便，敏感性高，特异性强，故日益受到关注。有关抗Hp-IgG检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）已有报道，但Hp抗原中，哪一部分是免疫反应中抗原的决定簇，目前各家均在探讨。因此我们对Hp抗原作了十二烷基磺酸纳一聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和用人抗血清Hp和兔抗Hp血清作免疫印渍（Western blot），现报告如下。
1 材料和方法
1.1 SDS-PAGE
①Hp抗原：为本室1989～1990年间分离培养的3株Hp抗原混合物。②CT抗原，由上海市卫生防疫站惠赠。③分子量标准蛋白。④电泳方法：分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺浓度分别为10%和5%，分离胶的pH为8.8，浓缩胶的pH为6.8。
电泳前先将Hp、CJ全菌经超声粉碎，然后离心（2000r/min）15min，除去沉淀，经紫外线检测，上清液中蛋白含量为2mg/ml左右，加拌量为60μl，上样前加20μl的样品处理液，然后将标本煮沸5min。相对分子量标准蛋白分别为磷酸化酶94000，牛血清蛋白67000，卵蛋白43000，碳酸酐酶30000，大豆胰蛋白酶抑制剂20000，溶菌酶14000与样品作同步电泳。
1.2 免疫印渍分析
①兔抗人Hp抗体：由本室免疫新西兰大白兔制成。②阳性血清：1989～1990年胃镜检查患者血清，1:100稀释后经ELISA后于波长490nm测定吸光度（A490）＞0.6者。同时，胃镜或胃粘膜病理证实有炎症或溃疡。尿素酶试验阳性。③阴性血清：选10岁以下正常儿童血清。1:100稀释后经ELISA测定后A490＜0.3者。④酶标羊抗人IgG的制备：按改良的过碘酸钠法，由本室制备。⑤酶标猪抗兔IgG：丹麦Daco公司产品，由上海市卫生防疫站生化免疫室惠赠。⑥硝酸纤维素（NC）纸：西德S&S公司产品，由上海市卫生防疫站生化免疫室惠赠。⑦免疫印渍：按Towbin等方法，由DY-Cl型电泳转移仪以2h400mA将SDS-PAGE胶上的抗原转移至NC纸上。将NC纸置Cohen封闭液中4°C过夜。次日，用含0.05%Tween-20的PBS洗涤3遍，再将NC分别浸于Hp阳性血清中（均为1:100稀释）。37°C振荡2h后，洗涤3遍，加酶标记的羊抗人IGG抗体和猪抗兔IGG抗体（1:400稀释）。37°C振荡2h后，洗涤3遍，再用酶底物显色液（pH7.2的Tris-HCl）缓冲液，0.05%DAB，0.03%的30%H2O2）显色。
2 结果
2.1SDS-PAGE
经超声粉碎后的Hp抗原被SDS-PAGE分离，胶块用考马斯亮蓝显色，可见14条左右的染色带。其主要染色带Mr分别为22000，32000，42000，59000，67000和75000。
经超声粉碎后的CJ抗原被SDS-PAGE分离后亦出现了10多条染色带。主要染色带Mr88000，75000，66000，45000和32000。
2.2Western blot
转移至NC上的Hp、CJ超声粉碎抗原用酶标羊抗人IGG抗体分析，发现在阳性血清的NC纸上，可出现三条抗原决定簇条带，其Mr分别为49000，59000和67000，与文献报道相似；加阴性血清的NC纸上，无任何条带出现。在国兔抗人Hp抗血清的NC纸上，用酶标猪抗兔IGG抗体分析，也出现了Mr67000的条带，49000和56000的条带较为模糊。在所有出现Hp抗原决定簇条带的NC纸上，CJ约在45000处与人抗Hp和兔抗Hp抗体均有一明显的交叉反应带。提示该条带并非是因人和兔都同时会有抗CJ抗体引起，而是Hp和CJ的表面蛋白抗原间有交叉反应。
3 讨论
我们用SCS-PAGE加Westen blot将分离培养的3株Hp抗原经超声粉碎后，进行抗原成分的分析，在14条左右的候选抗原带中，发现其主要的抗原决定簇Mr为49000，59000和67000。由于处理抗原的方法不同（如用福尔马林固定的整菌抗原、超声粉碎抗原及酸处理抗原等），因此，SDS-PAGE的结果也就不很一致。但目前公认Mr60000～70000的条带是用IGG印渍的Hp主要免疫反应带，与本组结果相同。印渍带属Hp的鞭毛鞘膜蛋白。另外，Dunn等用二维电泳分离Hp蛋白时，在用125I标记的完整Hp菌表面发现两种主要蛋白。其中命名为蛋白Ⅱ的（pH5.6-5.8,Mr66000）既是尿素酶抗原的亚单位，也是部分纯化的鞭毛蛋白制备物的成分。他们还发现，蛋白Ⅱ不被完整的CJ、CF抗血清识别，因此，它是Hp的抗原决定簇。此点与本文也相符。我们没有发现110000的Hp特异性蛋白带，这可能与培养的Hp菌株的不同有关。当然也不能排除与处理抗原的方法不同有关。
抗原的特异性及标准化至关重要，它决定了该免疫学方法的敏感性和特异性。作者试图通过对Hp的抗原的SDS-PAGE加Westernblot检测，找出Hp的特异性抗原决定簇，并以此来取代全菌抗原，建立更为灵敏、特异的血清学方法，从而有助于由Hp引起感染的流行病学调查。由于本文所用的Hp株数量有限，因此它的抗原决定簇可能代表不了所有的Hp株，但它至少反应了1989～1990年间上海地区感染的Hp菌的抗原决定族。
Clayton等在用基因工程合成的Hp多肽作为抗原与Hp阳性血清作免疫印渍时亦发现66000的合成多肽是Hp的一个主要抗原决定簇。这就为今后简化Hp菌的培养以及Hp菌的标准化、商品化都提供了很好的前景。