第一章 总论

根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白技术，免疫金-银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技术，免疫电子显微镜技术等。近些年来，核酸分子原位杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针，和免疫细胞化学技术密切结合，发展为杂交免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗休的制备，组织材料的处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。

（一）抗体的制备 这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体，这将在本书第二章　中详述。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质，能够自制较好。 （二）抗体的配制 包括抗体贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。 1．抗体贮存获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的抗体效价，将其分装，可每10μl或100μl/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中，密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存备用，一般可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在4。C可存入1~3天，超过7天效价显著降低。 2．抗体使用液的配制这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用的各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色结果。 （1）抗体最佳稀释度的测定方法：用已知阳性抗原切片，进行免疫染色，将其阳性强度与背景染色强度以“+”表示，可分为++++、+++、++、+、（-）。++++为最强阳性，+++为强阳性，++为较强阳性，+为弱阳性，（-）为阴性。 ①直接测定法：用于测定第一抗体的最佳稀释度，其它条件稳定可靠。将一抗稀释为1：50、1：100、1：2001：400、1：500等5个稀释度滴加在阳性抗原切片上，同时设一替代和阴性对照，结果如表1-1： 表 1-1 选择最佳稀释抗血清方法

一抗稀释度	特异性染色强度	非特异性背景染色度
1：50	++++	++
1：100	++++	++
1：200	++++	++
1：400	+++	+
1：500	++	（-）
阴性对照	（-）	（-）

从表中结果可见，第一抗体稀释到1：400时阳性结果呈强阳性，背景染色减少，其最佳稀释度在1：400~500之间。再作1：420、1：440、1：460、1：480、1：500稀释后染色，找出最佳稀释度。 ②棋盘（方阵）测定方法：当测定两种以上抗体的最佳配合稀释度时，必须采用此法（见表1-2）。 表1-2 两种以上抗体最佳配合稀释度选择表

第二抗体	第 一 抗 体
	1：500	1：1000	1:2000	1：4000
1：100	++++（++）	++++（+）	+++（±）	+（-）
1：200	++++（+）	+++（-）	++（-）	++（-）
1：400	++（-）	+（-）	-	-

括号内为背景染色结果 从表中可见第一抗体1：1000，第二抗体1：2000接近最佳稀释度，再将一 抗体作1：600、1：700、1：800、1：900和1：1000稀释，即可找出最佳稀释度。 （2）抗体稀释液的配制：常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液，防止抗体效价下降，减少抗体在组织上的非特异性吸附：取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml，加温到60。C，再加入优质明胶100mg，搅拌溶解后，冷却至室温，加入1g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后，过滤，分装，4。C保存。 抗体的最佳稀释度由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。

组织材料的处理是获得良好免疫组织化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏（下节　详述）。

可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：①标记抗体与标本中抗原反应结合；②用PBS洗去未结合的成分；③直接观察结果（免疫荧光直接法）；或显色后再用显微镜观察（免疫酶直接法）。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法，将在本书各有关章　节　内详述。
在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：
1．增强特异性染色的方法
（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶（pronase）等；也可用3mol/L尿素处理切片，达到酶消化的目的。各种酶的配制和使用方法详见附录。酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同，应根据酶的活性通过预试验确定，消化的时间还与组织固定的时间有关，一般是陈旧固定组织所需时间长，以37。C为宜。消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长能损伤组织，易使切片脱落，应使用切片粘附剂，消化时间尽量缩短。
（2）合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子过多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原，而是由于抗体过量。这种现象类似于凝集反应中的前带效应（Prozone effect ）。因此，必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长。③抗体中非特异性蛋白含量、只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色；④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键,应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应,减少或消除其中交叉抗体反应。
（3）温育时间：大部分抗体温育时间为30-60min，必要时可4。C过夜（约18h）。温育的温度常用37。C，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。37。C可增强抗原抗体反应；适用于多数抗体染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。
（4）多层染色法：对弱的抗原可用间接法（双层）、PAP和ABC法（三层）、四或五层PAP法或ABC法，或PAP和ABC联合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。
（5）显色增敏剂的应用，如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度4倍。
2．减少或消除非特异性染色的方法 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时，可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体,对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。
3．显色反应的控制 免疫酶染色应注意控制：①成色质浓度和温育时间可调节　，增加成色质的量和/或增加底物温育时间，可增加反应产物强度。着色太深可减少温育反应时间。②过氧化物酶显色时，H2O2较大浓度将使显色反应过快而致背景加深；过量H2O2可能抑制酶的活性。
4．复染 根据所用的染色方法和呈显颜色等，可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。也可用1%～2%甲基绿复染。

其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括：①阳性对照；②阴性对照；③阻断试验；④替代对照；⑤空白对照；⑥自身对照；⑦吸收试验。
（一）阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。
（二）阴性对照
用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。对照的具体方法步骤，在有关章　节　详述。

对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用PAP法阳性，可再用ABC法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
（一）阳性细胞的染色特征
免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。
（1）阳性细胞染色分布有三种类型：①胞浆；②细胞核；③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。
（2）阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。
（3）由于细胞内含抗原量的不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。
（4）阳性细胞染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。
（5）切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。
（二）染色失败的几种原因
（1）所染的全部切片均为阴性结果：包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是：①染色未严格按操作步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效；③缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2量少或失效；⑤复染或脱水剂使用不当。
（2）所有切片均呈弱阳性反应：①切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了；②缓冲液配制中未加氯化钠和pH值不准确，洗涤不彻底；③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长；④抗体温育的时间过长；⑤H2O2浓度过高，呈色速度过快；⑥粘附剂太厚。
（3）所有切片背景过深；①未用酶消化处理切片；②切片或涂片过厚；③漂洗不够；④底物呈色反应过久；⑤蛋白质封闭不够或所用血清溶血；⑥使用全血清抗体稀释不够。
（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应，固定和处理不当是最常见的原因。
对于阳性结果的定量判断常规方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、++、+++等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，本书第九章　将详细叙述这种使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另外，第十章　将详细途述另一种先进的免疫细胞化学计量分类术－流式细胞光度计技术。

免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十分重要的位置。
（一）细胞标本的取材
目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。CEA应用于胸腹水中间皮瘤与癌的鉴别。McAb应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等方面的研究均起到了积极作用。
细胞标本的取材有以下3种方法:
1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便粘附在玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。
优点是简便省时，细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。
2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸取病变区内液体成分，如穿刺液较少，可直接涂抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（RPMi 1640液）的试管内，轻轻搅拌，以500rpm低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂抹，待涂片略干即可固定。
该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补这一缺点，但操作复杂，细胞常常发生变形。
3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，更不宜加固定液。根据标本内细胞数量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者，可将液体自然沉淀，然后吸取5ml左右沉淀液，以1500rpm离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。
如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入涂片器内，离心后即制成分布均匀的细胞涂片，细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。
培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细胞、粘液癌细胞等，只需将载玻片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。
制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容易脱片，因此，在制备涂片前载玻片上应涂粘附剂。②为节　省试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径0.6-1.0cm的圆圈内，细胞总数以105个为宜。③粘液丰富的标本，如痰液，胃液等，未经特殊处理，一般不宜作免疫组化标记。
（二）组织标本的取材
组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记效果。但有些较稳定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。
组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：①活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；②取材部位必须是主要病变区；③必须取病灶与正常组织交界区；④必要时取远距病灶区的正常组织作对照。
为充分保存组织的抗原性，标本离体后庆立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮罐内或-70。C冰箱内备用。

（一）固定
为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。
不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失。而HBsAg属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。
（二）固定剂
用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。
1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。
（1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。
（2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混
合加热至60℃，搅拌并滴加1nNaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。
（4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。
戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。但McDonald等认为，该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。
（5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g,蒸馏水90ml）。
有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人认为它减弱细胞的抗原性，上皮细胞可产生非特异性荧光，故不宜用于免疫荧光标记。氯化汞是一种强蛋白凝固剂，但对组织穿透性弱，且使组织收缩，故与甲醛混合使用。
（6）醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）。
Bullock等认为此液固定效果良好，组织可不经消化，胞浆IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J链标记均呈阳性，且背景染色极淡。如标记IgG用PAP法第一抗体仅为甲醛升汞液的1/10。此液内醋酸既可防止组织收缩，又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。
（7）Bouin’s液。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。
（8）Zamboni’s液。
该固定液可用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存优于纯甲醛，也适用于光镜免疫细胞化学研究。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。固定时间6-18h。
（9）PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。
该固定剂适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合，从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定液有选择性地使糖类固定，既稳定缺的，又不影响其在组织中的位置（固定剂7-9配制法见附录1）。
2．非醛类固定剂Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。
（1）碳化二亚胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记IgA、IgG效果不佳。
（2）碳二亚胺-戊二醛液（ECD-G液）：配制法见附录一。
ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimideHydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐，简称乙基-CDI。
该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。
（3）Zenker’s 液（重铬酸钾2.5g,氯化汞5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,混合溶解后，临用时加水醋酸5ml）。
该固定液对免疫球蛋白染色最佳，固定时间约2-4h，染色前必须脱汞色素。
3．丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
（1）Clarke氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。
（2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。
Danos（1976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。
（3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml。
（4）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存备用。
（5）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存备用。
以上两种固定液适宜某些抗原，癌基因蛋白产物检测的 固定，P53抗癌基因蛋白产物，PC-NA等抗原的保存。
丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。
以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多（见附录），不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同，致使人们无所适从。选择最佳固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。
固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。④组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。
（三）固定方法
1．浸入法（Immersionmethod）将组织浸泡在固定液内，必要时可在低温（4。C）环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般在2-12h之间。
2．灌注法（Irrigationmethod）此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以krebs或生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注动物于4。C冰箱内，次日取出脑组织或其它组织。外周组织一般在灌注后30min内取材，取组织置同一固定剂中浸入1-3h，然后修整组织块。有主张用冷固定剂（4。C）进行灌注。我们的体会是一般光镜下观察的标本，室温固定即可获满意效果。应该强调，保持组织新鲜是很重要的，据报告，肽类抗原活性在断绝血液供应后24h几乎完全丧失。
灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。

应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。 1．冰冻切片 是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 （1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节　，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片 　其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表 1-3 组织块处理时间表

1	70%乙醇	4℃	3～4h
2	80%乙醇	4℃	3～4h
3	90%乙醇	4℃	2～3h
4	95%乙醇Ⅰ	4℃	2～3h
5	95%乙醇Ⅱ	4℃	1～2h
6	100%乙醇Ⅰ	4℃	1.5h
7	100%乙醇Ⅱ	4℃	1.5h
8	二甲苯Ⅰ	4℃	0.5～1h
9	二甲苯Ⅱ	4℃	0.5１～1h
10	石蜡Ⅰ	60℃	1h
11	石蜡Ⅱ	60℃	2h

以上全过程为18-24h，也可在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于0.5cm，可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h左右。 石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存，可存放于4℃冰箱内备用。 石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法（Freeze drying embedding methed），可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机（Freezing dryer）在真空、低温条件下排除组织内水分 ，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。 3．振动切片　 用振动切片机（Vibratotme），可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片20～100μm，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其实用于免疫电镜观察。 4．塑料切片　 塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类（Glycolmethacrylate, GMA）及环氧树脂类（Epon 812,618），其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可薄至0.5～2um，故称半薄切片（Semithinsection）。GMA保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如Fpon和Araldite能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。 5．超薄切片　 电镜标本制作见第七章　，应用超薄切片机（Ultrotome）进行切片。 6．碳蜡切片　 碳蜡（Carbowax），学名聚乙烯二醇（Polyethlene glycol, PEG）为水溶性蜡。根据其分子量不同，碳蜡有多种，如400、800、1000、1500、4000、6000等，用于组织包埋的有1500、4000两种，其熔点分别38℃C和52。C左右，常温下为固体石蜡状，加温熔化呈液体状。 本法的特点是组织固定水洗后，不需脱水透明可直接浸蜡包埋，且切片方法与常规石蜡切片相同。切下的组织片漂浮水面后自然展开，碳虹迅速深化，组织片即可展平，制片过程简单易行。 具体操作简述如下：组织块不宜过大，一般限定在1.5cm×1cm×0.1cm以内。①组织固定后充分水洗去除固定液，用滤纸吸干组织表面水。②将组织浸入碳蜡（1500）内，45℃30min。③再次浸入混合混合碳蜡液（1500和4000等量混合液），52℃30min。④浸入等量混合碳蜡液（或根据气温、湿度变化调整4000和5000混合比例，如气温高湿度大可以4000：1500=3：2混合，反之，则2：3混合）。⑤用等量混合碳蜡或调整混合碳蜡包埋成组织蜡块。⑥切片与石蜡切片相同。在操作过程中，碳蜡组织块应尽量避免与水或冰接触，贮存时应密封干燥冷藏。 本法优点是操作程序减少，时间缩短，组织不经有机溶剂损害、温度低、抗原性保存比石蜡切片好，组织结构清晰。缺点是夏季室温高时切片较困难，连续切片不如石蜡切片顺利；由于碳蜡有强吸湿性，不易长期保存。 7．玻片处理和涂胶 在免疫组化染色过程中由于各种原因常造成标本（细胞制片和组织切片）脱片现象，影响了工作质量和速度。一般采取两种方法即可防止脱片现象出现。 （1）载玻片和盖玻片处理：新载玻片上有油污，必须经过清洁液浸泡12～24h，流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5遍以上，浸泡在95%酒精内2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短，清洁液浸泡只需2h，流水冲洗注意勿损伤玻片等。 （2）载玻片上涂粘附剂：粘附剂种类较多，常用的有以上几种：①树脂胶（Resin glue）又称白色乳胶，为木工用，有进口，国产之分，有人认为进口白色树脂胶较稳定，我们认为国产白乳胶（聚醋酸乙烯乳液J-北京产）质量尚稳定。使用浓度为1%～2%，以蒸馏水稀释即可。②甘油明胶，混匀后涂在载玻片上，切片贴附后置有副醛的干燥器内，加热80℃1h。③甲醛明胶， 混合后即可涂片。④铬明矾明胶， 混合后即可涂片，置37℃温箱烤干。⑤多聚赖氨酸液：多聚赖氨酸0.1g，加蒸馏水10ml，混合后即可涂片。此液不宜多配制。⑥3-Amino propy Eri-ethoxy Silame（APES）。 粘附剂2～5配制法见附录一。

1．Bullock CR, etal . Techniques in immunocytochemistry, Vol 1. London New York: Academic Press,1982
2.Coleman DV, et al.Immunoperoxidase staining tumor marker distribution studies in cytologicspecimens. Acta Cytologica, 1981:25:205～206
3.Jacobsen M, etal .The effectof fixation and trypsinization on the immunohistochemical demonstration ofintracellular immunoglobulin in paraffin embedded material .Acto Path.Microbiol . Scand . ,Sect. A, 1980;88:369～376
4. Kayhko?K. Optimal fixation ofthe immunoperoxidase identification of human J chain from tissue sections.Histochemistry, 1980;70:23-27
5.Leathem A, et al .Fixation andimmunohistochemistry of lymphoid tissue.J. Clin Path, 1980;33:1010-1012
6.Martin SE,et al Immunologicmethods in cytology:definitive diagnosis of non-Hodgkin’s lymphomas usingimmunologic markers for T-and B-cells .Am . Clin . Path.,1984;82:666～673
7.Mason DY,et al, Technicalaspects of lymphoma immunohistology.J. Histochem. Cytochem., 1980;28:731-745
8.Montero C.Immunocytochemistry.2nd ed. New York; John Wiley and Sons, 1979
9.Walts AE, et al.SPecial tumormarkers in diagnostic cytology:immunoperoxidase of carinoembryonicantigen,lysozyme and other tissue antigen in effusions, washes and aspirates.Acta Cytologica, 1983;27:408～416
10.Wordinger RJ, et al. Manual ofimmunoperoxidase techniques. Chicago; Americal Society of Pathologists Press,1983
11.施达仁，等。B淋巴细胞双PAP法免疫定位方法学的探讨及其在恶性淋巴瘤诊断上的应用。肿瘤，1982；2：11-14
12．Nuovo GJ.Comparison of Bouin solution and buffered formalin fixation on the detectionrate by in hybridization of human papillomavins DND in qenital tract lesions.