章节内容
第一节 固定和切片
一、固定
若想得到理想的ICC染色结果、正确地判断抗原物质在组织细胞内的位置，除需有良好酶和抗体外，保持组织细胞内抗原物质的不动性（Immobility）和免疫活性也是至关重要的。换言之，如果抗原物质在组织细胞间弥散、丢失或失去免疫活性，无论如何努力染色都是徒劳的，所以说固定是ICC染色中非常重要的一环。ICC与其它组织学技术不同，除要求保存良好的结构外，还需保存组织抗原的免疫活性。一般认为，新鲜组织能够最大限度地保存组织抗原的免疫活性，但结构较差，易出现抗原弥散丢失现象。Cumming（1980）报告，不固定的组织切片ICC染色时，环鸟苷酸含量丢失80%以上。固定的目的是使构成组织细胞成分的蛋白等物质不溶于水和有机溶剂，并迅速使组织细胞中各种酶降解、失活，防止组织自溶和抗原弥散，保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的关键一步。用于ICC的固定剂种类较多，选择时应根据所要检测物质的抗原性质和切片方法以及所用抗体特征等做最佳筛选。制片及固定方法见第一章 ，下面介绍两种近年报道的新方法。
1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ）法是改良的冰冻置换法（freeze substitution）的简称，主要用于石蜡包埋标本。Sato(1986)报告，该法具有同新鲜（未固定）组织冰冻切片同样的抗原保持性和石蜡切片的良好组织结构保存。其机制为：组织在丙酮中固定（脱水），组织细胞内水份逐渐被丙酮取代，继之，用苯甲酸酯取代组织内丙酮，经二甲苯置换后，石蜡包埋。组织在-20℃丙酮内过夜亦形成冰晶，所以原方法将组织先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮过夜。实际上组织在4℃丙酮内过夜亦可得到同样效果。如在该固定液内加入少量蛋白酶活性阻断剂，并采用低溶点石蜡包埋等，可获得更佳染色结果。
2．微波固定（Microwave fixation）为近几年所注目的问题之一。该方法能保持良好的组织结构和抗原性，适于各种切片的酶组化、ICC以及免疫电镜等材料固定。其固定机理可能与微波（频率1000～3000MHz）具有被水分吸收的性质（通常所用的微波是频率2450MHz，波长12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，温度升高，分子运动加快，促进固定液向组织内渗透，加速与组织成分的反应，短时间内达到固定的效果等有关。经微波照射固定的组织，需置相同固定液中，继续固定2～6h，室温。
近年研究的专门固定用的微波炉已商品化，例如：Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE-2等，该类微波炉能够准确地调节 照射时间和测定被照材料的瞬时温度。利用家庭微波炉代替时，应选用能以秒为单位调控的微波炉。实验材料不同，所需固定液的量、照射时间等各异，所以应在预实验的基础上，找出合适的固定液量、照射时间和温度。多数实验室的条件为：固定液5～10ml，照射10～30s，照射后固定液的温度≤50。C。其方法为：将实验标本置于微波炉旋转台的中央，周边放一烧杯盛300～500ml纯水，吸收照射时炉内产生的热量，选择强挡照射10～30s 。接通电源（on）至微波产生利用超声波代替微波照射，或二者并用，照射后，组织标本和固定液的温度升高较少，亦能获得短时间内良好的固定效果（Yasuda 1992）。
二、切片
光镜ICC染色，常用的有冰冻切片和石蜡切片两种，二者各有其优缺点，应根据抗原的性质、实验室条件，合理选择之。对未知抗原显示时，最好同时应用。冰冻切片为ICC研究所首选。
Shi（1991）等报告：微波炉照射的切片，能够激活部分核内抗原活性。其机制不清，可能与高温、高热的作用，使核内DNA双链解开，DNA、RNA解离，抗原暴露有关。其步骤为：将切片脱蜡水洗后，置染色瓶中，加入去离子水或缓冲液至瓶颈处，反复多次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，补充瓶中蒸发掉的液体，照射温度不超过90～95℃为宜。此处理后，细胞核染色以苏木精为佳（详见第一章 ）。
第二节 染色方法
一、本科标抗体法
酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。
（一）酶的种类及特点
| 名 称 | 分 子 量 | 内 源 性 | 商 品 |
| Horseeradish peroxidase(E.C.1,11,1,7) | 40～45KD | + | 有 |
| Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1) | 80～120Kd | ++ | 有 |
| Acid phosphatase (E.C.3,1,3,2) | 100Kd | +++ | 有 |
| Glucose oxidase | 160～190kD | － | 有 |
（二）本科标抗体的制备（Boosma,DM, 1983）
酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥-偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结；②偶联剂不应影响酶和抗体的活性；③不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。
在HRP标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠及Maleimide等，现简介如下。
1．戊二 醛标记法戊二醛为制备各种酶标抗体最常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯释及戊二醛自身聚合本等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的二醛的单体戊二醛的OD比值表示，它们的最大吸收光波长分别为235nm 和280nm，二者的OD比值（235/280）小于3时，制备酶标抗体的效果较好，大于3时，需经蒸馏或Sephadex G-10柱层析或活性碳吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法；基本原理相同，是使戊二醛的两个醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连结于抗体上。
（1）一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋白的氨基数远较HRP为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据Nakane等推算，加入的HRP仅20%与抗体连结，标记率较低（约1%～5%）很难获得理想的酶标抗体。
（2）二步法：首先用过量的戊二醛与HRP反应（HRP：戊二醛为1：105），以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离；然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛复合物），再加入过量的抗体，使活化HRP上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的HRP与抗体（IgG）比例不同，酶标记率各异，平均为5%～25%。标记步骤如下：
①10～15mgHRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸缓冲液配制），18h室温。
②透析或 SephadexG-25柱层析（0.15mol/l NaCl平衡），去除过量的戊二醛，收集活化HRP。
③浓缩活化HRP至10mg/ml左右，加入抗体5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。
④碳酸盐缓冲液（pH9.5）调整pH至9.0～9.5,使抗体与活化HRP结合，4℃24h。
⑤加入0.1ml赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4℃，2h。
⑥用半饱和硫酸铵沉淀5次，对PBS透析24h，4℃，换3次PBS，除去硫酸铵（10000rpm/min,30min）。
⑦或用凝胶色谱法（SephadexG-200/Sephacryl S-200） 等分离标记抗体。
注意：该方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体；而RZ值小于2.8的HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。
2．过碘酸盐氧化法严格地讲，过碘酸钠（Sudium periodate）不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶（如HRP）的标记。我们知道，HRP分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的-CH基，使之生成-CHO基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成Shiff’s碱。此Shiff’碱在pH降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠（NaBH4）还原，形成稳定的酶标抗体复合物（图4-1）。为防止生成的-CHO基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene）处理HRP，阻断分子内的ε-、α-氨基。
shiyongmianyixibaoyuhesuan021.jpg 过碘酸盐氧化原理
图4-1 过碘酸盐氧化原理
过碘酸盐氧化法，酶的RZ值≥3时较佳；RZ<3时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的HRP和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70%左右。具体步骤为：
（1）4mgHRP(RZ=3.0)溶于1.0ml双蒸水中。
（2）加0.2ml新鲜配制的0.1mol/LNaIO4，轻轻摇动混合20min,肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。
（3）对0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH4.4）透析，20h，4℃。
（4）调整HRP液体的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5),立即加入抗体(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸盐缓冲液溶解),轻轻混匀后,置室温2h。PH≤8.5时,抗体的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能与CHO基反应,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。
（5）加入0.1ml新鲜配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以稳定酶标抗体复合物。
（6）经透析等去除未反应的NaBH4，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法）。
如此制得的酶标抗体，加入终浓度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）分装后于-80℃可保存数年；亦可加入6%等量甘油，混匀置-20℃/4℃保存1年左右。上述两种标记法是ICC研究中最常用的酶标抗体制备方法。
3．Maleinmide法上述酶标抗体（IgG）的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体（1个HRP分子标记1个IgG分子）的分子量为190～200kD，非标记抗体为146～150kD，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以,Sternberger等进行了抗体片段Fab的标记。用植物性蛋白酶---木瓜酶（Papain）水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的Fc段结晶和两个相同的抗原结合片段（Fab），此Fab段为单价，分子量50kD,HRP标记后，单体分子量为90kD,较容易将单体和非标记的Fab段分离。在此基础上，Imagawa(1982)又进行了改良，引入了N-羟基丁二酰酯（Maleinmide），标记抗体的特定部位---Maleinmide法。该方法的主要原理是：（1）借助双功能试剂Maleinmide活化HRP，使其具有与—Hs 基反应的能力；（2）利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重链在近羧基端被切断，这样在绞链区（Hinge region）至少可以保留一个S-S键，从而得到一个具有双价抗体活性的F（ab＇）2段。该S-S键与抗体活性无关。可以通过加入硫基乙醇（2（β）-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH）使其断裂，被还原成—HS基 。如此双价抗体活性的F（ab＇）2片段即变为带有—Hs 基的单价Fab’片段，后者再与活化的HRP结合，便制成了酶标抗体Fab＇。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个—HS基，也只能有一个能与酶结合，另一个—HS基不能与酶反应，即酶与抗体Fab’段结合比例为1：1，因此酶标抗体Fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化HRP，还能避免非标记抗体Fab＇段的存在。Fab＇段的分子量与Fab段相似（50kD左右），所以酶标后Fab＇亦较容易与未标记的Fab＇分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：
①6mg HRP溶于1.0ml PBS(pH7.0)中。
②4mg Maleinmide 溶于0.5ml N, N二甲基酰胺（N,N-dimethylformamide）中。
③将上述两种液体充分混合，持续搅拌1h,30℃。
④离心取上清，经0.1mol/lPB(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化HRP。
⑤每1.8mg活化HRP，加入已被还原的Fab＇2mg,4℃20h持续搅拌。
⑥ Sephadex G-200/Sephacryl S-200分离酶标抗体Fab＇片段，保存同前。
（三）酶标抗体的纯化
上述各种方法制备酶标抗体时，除产生酶标抗体外，还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降，故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。
1．多聚体的分离实验中，不同的试剂形成的多聚体的数量各异，即使同样的实验药物和程序，在不同的时间制备的酶标抗体中，多聚体的数量亦不相同。多聚体较单体含酶量多，与组织的非特异吸附增强，使方法的敏感性下降，故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。
2．非标记抗体的分离 非标记抗体与标记抗体具有相同的免疫学特征，能竞争与组织特异抗原结合，而且亲和力较标记抗体强，优先与组织抗原结合。一般认为每个抗体连结1～2个酶分子，并不影响抗体的两个（Fab）抗原结合点，但因存在空间遮蔽现象，一个Fab段与组织特异性抗原结合。非标记抗体则不存在这种现象，两个Fab段均与抗原结合，因而亲合力较强。所以酶标抗体在应用前须用琼脂糖亲合层析等方法去除非标记抗体。
3．亲合层析 利用蛋白A（Protein A）/琼脂糖-刀豆素A/琼脂糖亲合层析柱能制得较纯的酶标抗体。因为蛋白A与抗体（标记和未标记）间有较强的亲合力，不与HRP结合。而刀豆素A与HRP（标记和游离）间的亲合力非常强，不与抗体结合。据此二者并用，能获得较纯的HRP酶标抗体。该方法省时，分离能力强（约为凝胶层析的600倍）。但有一定的局限性，因为蛋白A并非与所有种属的免疫球蛋白亲合力均较强，例：不能与羊的免疫球蛋白结合，所以难以用于纯化羊的酶标抗体。而刀豆素A与HRP的亲合力极强，甚至呈不可逆性结合，可使部分酶标抗体的活性丧失。
（四）染色原理及步骤
1．基本原理酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体则为第一抗体（家兔/小鼠的IgG）的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色程序。
2．染色程序
（1）切片准备：见第一章 。
①石蜡切片经二甲苯或Hemo-De脱蜡，下行酒精至水。②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上。
（2）未固定的新鲜组织切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽（室温），风干15～30min.;已固定的组织冰冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。
（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节 省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。石蜡切片（滴少量PBS，以防其干燥）直接进行步骤（6）。
（4）切片经PBS或其它缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的OCT包埋剂。但应用ALP标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使ALP失活。
（5）根据需要，用甲醇+0.3%H2O2处理切片15～30min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。应用ALP标记抗体时，此步可省略。
（6）PBS漂洗2min（共两次），移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室温）。Tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。
（7）4%BlockAce或0.1%～1%BSA湿盒内孵育15～25min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。
（8）根据需要，可用1/5～1/30正常来活兔/羊血清孵育15～20min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时，加入1%～2%的同一种属正常血清。
（9）轻轻弃去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀释的第一抗体（抗体用量：每张切片一般为50～80μl），湿盒内孵育1～2h（20～25℃）；免疫电镜用标本，4℃过夜。
（10）PBS充分冲洗（3次×2min），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。
（11）经0.05%Tween-20/PBs2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀释的HRP酶标记的第二抗体,湿盒内孵育45～60min(20～25℃)。
（12）PBS漂洗（3次×2min）,此处不需分别漂洗，因所有切片均系同一酶标抗体孵育。
（13）未固定或固定较弱的冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸钙而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第一抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的ICC染色。
（14）呈色：HRP标记抗体的呈色液为0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片经PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色3～5min即可，防止DAB终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免DAB本身氧化变质。新配制的DAB为无色透明液体。若DAB液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。
（15）将切片置流水中（仅光镜观察）或PBS（电镜标本）内，终止呈色反应。
（16）未固定的冰冻切片，可用1%戊二醛-PBS液加强固定5～10min（室温），流水冲洗。
（17）细胞核轻度染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与HRP/ALP等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与HRP、ALP的终产物对比度比较好。
（18）DAB呈色的标本，可以系列酒精脱水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少许女士用指甲油，可使切片保存时间更长。
（19）镜检、观察记录同一般形态学研究。
（20）免疫电镜用标本，经OSO4后固定，按电镜标本要求处理（参见本书第七章 ）。亦可OSO4固定，喷碳（Carbon Coating）,利用扫描电镜观察抗原的存在部位。
3．酶标抗体及发色剂的选择
shiyongmianyixibaoyuhesuan022.jpg
HRP特异底物为H2O2,在分解H2O2过程中,与H2O2形成复合物,无电子供体存在时,反应不再进行,当电子供体存在时,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化环化,形成苯乙胼聚合体(图4-2)。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。
shiyongmianyixibaoyuhesuan023.jpgDAB反应产物形成过程
图4-2 DAB反应产物形成过程
HRP催化的酶促反应第一步是特异性的—酶催化底物H2O2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol）为蓝黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine ）为深蓝色，AEC（3—amino—9– ethyl--carbazole）为红色。市售试剂盒所配显色液以AEC居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，且时间长易褪色。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明、半永久保存，且终产物具有嗜饿性，经O2O4处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是DAB被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。
（2）ALP，是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。显色液内加入终浓度为2～4mmol/l的levamisole, 大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole）以每毫升60～120mmol/L浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，As-Mx、FR、FB试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液30ml计算，分装As-Mx 5～7mg/支、Fr8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀释30倍，过滤显色。FR、FB等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。
（3）GOD，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD的敏感度较HRP和ALP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用GOD和HRP分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为GOD标记的兔抗鼠IgG，第三抗体则为HRP标记的羊抗兔IgG），ICC染色，以葡萄糖-DAB作显色剂。基本原理如（图4-3）。在这里HRP是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的H2O2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且GOD和HRP所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：
①切片经第一抗的孵育；②漂洗，GOD标记的第二抗体孵育40～60min（室温）；③漂洗，HRP标记的第三抗体孵育30～45min（室温）；④漂洗，显色、脱水透明观察同前。
shiyongmianyixibaoyuhesuan024.jpg两步酶催化反应原理
图4-3 两步酶催化反应原理
二、非标记抗体酶法
由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（PeroxidaseAntiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。
（一）酶桥法
1．基本原理首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。
2．染色步骤 主要程序如图4-4
shiyongmianyixibaoyuhesuan025.jpg酶桥法主要染色步骤
图4-4 酶桥法主要染色步骤
（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。
（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a IgG抗体）孵育1～1.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。
（3）切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1～1.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。
（4）切片与酶（HRp70～100μg/ml,PBS溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。
（5）显色等与酶标抗体法相同。
酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。
（二）PAP法
1．PAP的制备及特征 PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。
（1）制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。
（2）制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3），而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。
【步骤】
①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml）的水溶液。
②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃15min。
③0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃15min，重复4次。
④加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg），室温，持续搅拌。
⑤用1N HCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N 及0.1n NaOH调pH至7.2。
⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃45min。
⑦离心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。
⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。
【质量鉴定】
制备的PAP复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定PAP复合物的质量。常用分光光度计检测PAP的复合物在280nm（IgG的最大吸收波长）和400nm（HRP的最大吸收波长）的光密度值（OD值），按下式计算IgG和HRP的含量：shiyongmianyixibaoyuhesuan026.jpg
一般HRP/抗HRP的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的PAP复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的PAP复合物不稳定，4℃可保存2～3周。最好临用前配制。
【PAP复合物的特征】
PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。
2．PAP染色原理及步骤
（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。
（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。
①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。
②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。
shiyongmianyixibaoyuhesuan027.jpgPAP法主要染色步骤
图4-5 PAP法主要染色步骤
③用离体制得的PAP复合物（1：30～300稀释）孵育1～1.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用ALP抗ALP复合物代替。
④显色观察等同间接法。
3．PAP法的评价PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：
（1）抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。
（2）灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N）表示。据此，Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节 省其用量。但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。另外，PAP复合物分子量较大（400KD）,冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90～180kDa），所以不适于免疫电镜的标本制作。
（3）背景染色低：在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色（图4-6）。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属IgG的特异性抗体，故亦不能与抗HRP抗体结合，不能把PAP复合物连结在此非特异性抗体上（图4-7）。当然，PAP复合物内也可能存在些非抗HRP的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗HRP的抗体，故不能与HRP结合，无酶活性。因此说桥抗体的引入，使ICC的特异性得到了双重放大，S/N增大。但也有人认为，过量的桥抗体及PAP复合物等均易与Fc受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常血清以阻断非特异性结合，加之适当地选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，PAP法和间接法二者的背景均相当低。
shiyongmianyixibaoyuhesuan028.jpg间接酶标抗体法
图4-6 间接酶标抗体法
背景染色增高原因
shiyongmianyixibaoyuhesuan029.jpg PAP法降低背景的原理
图4-7 PAP法降低背景的原理
（4）假阴性及其处理：应用PAP法显示抗原含理较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好的标本时，可导致阴性结果，这种现象称为假阴性。Vandesand发现：应用PAP法显示大鼠视上核和室旁核内加压素神经细胞分布时，第一抗体（1：200）染色，加压素含有细胞呈强性。如果取材前24～48h，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核加压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至1：1500时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。Bigbee（1977）认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个伉体的Fc段间的距离（d）恰好是连结抗体的两个Fab段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离Fab段，仅剩无活性的Fc段，所以不能将PAP复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性（图4-8）。因此，借助PAP法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以PAP法在石蜡切片的ICC观察中更为常用。
shiyongmianyixibaoyuhesuan030.jpg假阴性及其处理
图4-8 示假阴性：组织切片上结合过多的第一抗体，两抗体间的距离d 恰好适于桥抗体的两个Fab段与之结合，无PAP复合物结合的位置
（5）桥抗体：也称连结抗体，它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当第一抗体和PAP复合物中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个Fab段之一与第一抗体结合、另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白A（SPA）代替桥抗体，进行ICC染色。SPA不受种属限制，应用范围广。
（6）PAP复合物：在PAP法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗HRP抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起；但一些研究表明：第一抗体和抗HRP抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如Erlandsen发现豚鼠IgG作为第一抗体，可用羊抗兔IgG、兔PAP复合物显示之一。Grzanna（1982）根据这一报告，利用豚鼠抗DBH血清作第一抗体，羊抗兔IgG为桥抗体，12例兔血清制得的PAP复合物中，仅3例染色较佳。这种第一抗体和PAP复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行ICC染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜。
第三节 结果分析
ICC染色结果判断与其它组织化学相似，应在熟悉所应用方法、抗体的优点和局限性的基础上，避免主观意识，进行客观判断。一般认为在严格操作、控制染色的条件，选择特异性抗体等条件下，所得结果是阳性时才有积极意义。而阴性时，不一定意味着该物质或抗原不存在，即不能排除实验过程所致的抗原丢失或抗体选择不当等引起人工假象。另外根据ICC染色强弱做半定量分析时，必须是同时固定、相同的组织块、相邻/同一切片，在严格控制抗体用量和显色时间等条件下，进行图象测定，否则无法相互比较。镜检时，首先从对照标本开始，判断固定是否合适、非特异性着色强弱等再从低倍至高倍顺序观察实验标本，预期阳性部位是否被染色，不该含此类物质的部位是否阴性等。一般认为，切片边缘的较强染色，属于非特异性着色，所以应避免作为阳性结果的依据。同时应结合对照实验、鉴别假阳性，以便做出正确判断。
一、对照实验
1．常用的吸收实验分固相吸收和液相吸收两种（见本书第一章 ），对于不能形成沉淀，难以用离心沉降法分离的一些小分子多肽类抗原，以固相吸收为佳。一般市售抗体均经特异性检测，所以应用购买抗体时可省略此步。
2．交叉实验 我们知道，引起机体免疫应答反应的并非是免疫原整个分子，而是其中的一部份—抗原决定簇。每个抗原可能有不同的抗原决定簇，不同的抗原亦可能有类似的抗原决定簇，因此一种抗血清可能与几种抗原结合。所以同时最好亦用结构相近的抗原做吸收实验，以避免抗原间的交叉反应。
3．替代实验 用制备第一抗体相同种属的正常血清（1/10或相同IgG浓度）替代第一抗体或用第二抗体相同种属的正常血清替代酶标抗体/桥抗体或省略其中任何一种免疫试剂或酶等，以PBS代替之，分别孵育切片，结果均应为阴性。
4．置换实验 应用无关的特异性抗体代替第一抗体，孵育切片，结果应阴性。如果同时进行几种特异性抗体的ICC染色时，彼此之间即为此类对照。例如，无关的数种抗体，均在相同部位出现类似阳性结果时，非特异性着色的可能性较大，应慎重判断。
5．阳性对照 不具有ICC染色经验者，从事此项工作时，最好同时染色已知阳性标本，以排除操作过程失误所致的染色阴性。阳性标本切片最好冰冻保存备用。
另外，在观察新的组织抗原时，最好同时比较不同的固定的组织标本、冰冻切处及石蜡切片的ICC染色，选择最佳条件，以期得到良好的实验结果。
二、假阳性及其处理
组织成分与各种染色试剂及抗血清之间的非特异性结合称假阳性，其主要原因和处理方法如下：
1．组织细胞内色素 与DAB沉淀物颜色类似的色素，例如黑质内的神经黑色素，不易与反应产物区别开来。可用其它电子供体或免疫荧光技术鉴别之，亦可改用ALP代替HRP，进行染色。
2．假过氧化物酶活性RBC内的血红素辅基有类过氧化物酶活性，当组织内存在红细胞时，即使不加过氧化酶，亦可出现阳性染色。用甲醇-0.3%H2O2孵育标本15～20min（室温），能抑制这种假阳性。甲醇可以使血红素蛋白中的（亚铁）血红素游离，后者被H2O2破坏，从而抑制类过氧化物酶的活性。一般认为，RBC的染色容易同其它组织细胞区别，且动物实验还可通过灌注冲洗组织内的RBC，所以此步往往被省略。
3．内源性过氧化物酶活性粒细胞、巨噬细胞等存在内源性过氧化物酶，能够与DAB-H2O2反应，导致假阳性，所以含此类细胞较丰富的脾脏、肝脏、骨髓等组织，ICC染色时，最好做内源性酶阻断。适当的固定、经酸酒精孵育15～20min，或1%乙酸-甲醇硝基铁氰化物处理，冰冻切片可用苯肼孵育15～20min，均能不同程度地抑制内源性酶的活性。近年Li(1987)报告，应用0.1%NaN3 0.3%-- H2O2孵10～15min（室温）能较好地抑制内源性过氧化物酶的活性，冰冻切片效果尤佳。嗜酸性粒细胞内源性过氧化物酶活性较强，上述各种处理后，仍残留部分活性，此种情况，在DAB-H2O2显色液中加入终浓度为0.05NaN3,基本上可达到完全阻断的作用。但是，各种封闭内源性（假）过氧化物酶方法均不同程度地破坏组织的抗原性，所以在不影响反应结果判断或能够同内源性酶的反应所致的假阳性区别时，尽量避免此类处理或改用ALP代替HRP进行ICC染色，也可以在用第一抗体与抗原反应结合后，再进行消除内源酶的处理。
4．游离醛基醛类固定的组织切片上，可能存在些游离醛基，后者能与蛋白质（含IgG）间非特异性结合，导致假阳性，用白蛋白或封闭性阻断等预先孵育切片，可封闭之。
5．疏水键和离子键免疫球蛋白可通过疏水键或离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体（冰冻切片Fc受体保存尤佳）非特异性结合。用正常血清（制备第二抗体种属的血清为首选），于第一抗体前孵育切片，可消除之。“4”和“5”重叠应用，更有利于降低背景染色。
6．天然抗体及不纯抗体 天然抗体是指因动物自然感染等原因血清中存在的部分抗体：不纯抗体是指在制备血清时，所用的抗原不纯，获得的抗体含有杂质抗体。当天然抗体或不纯抗体与组织成分结合时，可引起非特异性染色。上述二者的含量均较低，增加第一抗体的稀释度，可以降低其非特异性染色。
7．载体蛋白抗体 制备小分子多肽（分子量小于4kD）的抗体时，需借助载体蛋白，使小分子多肽获得免疫原性，刺激动物产生特异性抗体。因载体本身具有抗原性，故动物同时也产生抗载体蛋白抗体，与组织蛋白结合后，引起背景染色。用固相吸收技术，能将载体蛋白抗体除去。一般市售抗体，均经特异性检测，所以“6”和“7”可不必考虑。
三、抗体有关事项
1．血清特异性检测 为了发现新的物质或其它方法未能显示的物质、而又无相应抗体可购买时，往往需要自己制备抗血清。制备时应检测抗血清的特异性。常用的方法有：
（1）放射免疫分析（RIA）、免疫扩散或电泳及ICC法：在制备抗血清的过程中 ，用RIA和免疫电泳等方法检测抗血清的效价是不可少的。一般认为，RIA和免疫电泳的最佳稀释度较高。ICC染色时，应从其1%的稀释度试用之较合适。在制备ICC用抗血清时，最好在应用RIA和免疫电泳法的同时结合ICC染色，以鉴定抗血清的质量（制备单克隆抗体时，仅用ICC染色筛选特异克隆即可）。因为免疫过程中，各个时期抗血清效价不同的，例如给动物免疫催产素，7周时血清ICC染色较好，RIA不佳；在10～12周期间，RIA效价升高，但ICC染色较差。因此制备ICC用抗血清时，应在ICC染色效价最佳时，收集抗血清。
（2）系列稀释第一抗体法：在一定稀释度时，抗体的特异性结合最强；继续增加抗体的稀释度，特异性反应将随之减弱至消失。因此采用系列稀释第一抗体的方法，能够验证抗血清的特异性。
2．抗体的选择 原则上应选择在较高稀释度时染色较佳而背景较低、结果稳定、重复再现良好的抗体。目前供ICC研究用的抗种类繁多，制造商如林，不同的厂家的相同抗体，其价格、包装及抗体的最佳工作浓度，差异较大。所以选购时，应多听取有经验者的建议，参考文献报告，并且自己应多查找不同厂家的抗体商品目录，恰当地选购自己所需的抗体。
3．抗体最佳稀释度的检测 抗原抗体反应要求一定比例，过量或不足，均不能达到预期的结果，所以ICC染色时，应进行抗体最佳稀释度的检测。市售抗体所附说明书均标有工作液浓度，但实际上，厂商常常给较低的稀释倍数，因此应用时，可将所给工作液浓度稀释数倍至数百倍再进行系列染色，选择其中特异性染色最强、背景着色最低的释释度作日常ICC染色浓度。在抗体来源不明、又无任何可供参考依据时，则可从原液至数倍稀释试用。另外，酶标抗体/连结抗体和PAP复合物等也需要确定最佳工作液浓度。一般认为酶标抗体可用稍离浓度，例如HRP标记抗体为1：80～160、ALP标记抗体为1：50～100染色较理想。PAP法染色时，连结抗体稀释1：50、PAP复合物用1：50～200染色较合适。
4．抗体的保存 为确保ICC染色结果稳定、再现性良好，应避免抗体反复冻融所致的效价降低。第一抗体分装、冷冻保存为佳，其最小包装可为每次用量或2周内用量。例如某抗体的工作液浓度1：1000～2000，每次染色需抗体量为1～4ml时，则所需原液为1～2μl。将原液分装成几微升难度较大，所以先将原液稀释为1：10～100，每支离心管内10～100μl保存，应用前稀释至工作液浓度。后者不宜冰冻，4℃可保存2～3周，原液和1：10～100的抗体在-80℃可保存数年而染色结果不变。单克隆抗体为培养液上清或腹水时，应4℃保存，应早应用。酶标抗体和PAP复合物原液4℃保存1年左右，免疫活性和酶活性不发生改变，大量制备的酶标抗体/PAP复合物最好分装后于-80℃或-20℃保存。所分装的抗体，应注明名称，稀释度、量及日期等，同时应在笔记本详细记录。ICC研究所用的任何抗体及酶，均应严格记录，妥善管理，才能保证实验成功。
四、单克隆抗体
在单克隆抗体问世前，ICC染色中通常所用的抗血清均为多克隆抗体，即抗血清含有多少B淋巴细胞株所分泌的抗体，这些抗体的性质不完全相同，不同的抗血清之间可能有交叉反应，使ICC染色受到一定限制。近年，单克隆抗体的引入，特别是市售单克隆抗体和种类和数量的迅猛发展，及各实验者比较容易制备自己所需的单克隆抗体，为ICC染色在特殊抗原定位、生物活性检测、肿瘤标记识别中，开辟了更广阔的前景。
1．单克隆抗体的制备（Oi,TV, 1980）(详见第一章 )。
2．单克隆抗体的特点
（1）酶标抗体：自己制备或市售商的单克隆抗体，绝大部分为小鼠IgG、Kappa型，所以酶标抗体选择抗小鼠IgG的多价抗体，进行ICC染色比较稳妥。
（2）特异性：专一性强：单克隆抗体是由同一细胞株分泌的，性质均一，且有相同的亲合力，识别同一抗原决定簇。这在研究某些类似物质的局部定位、分型、生物活性检测及肿瘤诊断等方面有重要意义。但同时也应注意，不同抗原的相同抗原决定簇有被识别的可能，所以应结合其它方法，判断其结果。
（3）不需纯化抗原：多克隆抗血清在制备时，要求抗原相当纯。而制备单克隆抗体时，不需纯化抗原。一些不能纯化的组织（游离）细胞可直接免疫，经克隆化，筛选所需细胞株，避免了纯化抗原的麻烦，这在研究人类各种疾病等有重要价值。
（4）工作液浓度：不同的单克隆抗体效价各异，所以ICC染色时需检测最佳稀释倍数，大量培养纯化的抗体可用更高的稀释倍数。
（5）切片选择：单克隆抗体仅识别抗原物质的某一抗原决定簇，所以以新鲜组织的冰冻切片为首选。因为在固定过程中，可能使抗原物质发生某些改变，致使其与单克隆抗体反应的抗原决定簇丢失，故拟用石蜡切片固定组织冰冻切片。ICC染色时，在制备单克隆抗体过程中，应该用同样标本和方法筛选所需细胞株，才能确保染色成功。
（6）特异性检测：单克隆 抗体的特异性强，性质均一，没有必要进行RIA分析和吸收实验等。自己制备的单克隆抗体，其特异性检测最佳方法为相同组织提取物质进行免疫电泳，确定抗原的分子量等。
（7）发现新物质：在制备肿瘤或其它组织细胞单克隆抗体时，往往有各种各样的抗原特异性杂交瘤细胞株产生，在筛选过程中，能够发现一些新的杂交瘤株，经培养制备相应的抗体，用于一些新领域的研究。
五、增加染色强度方法
通常染色、着色较弱时，应想办法改进标本的处理的抗原的保存，提高抗体的穿透力，再重新染色。但有时组织本身抗原含量较少或标本难得（如手术材料），可尝试下述方法以提高染色强度，确保染色成功。
1．重复显色一般认为，对ALP标记抗体，延长显色时间其反应可增强。但在同一染色液中延长显色时间，往往容易产生沉淀，出现终产物弥散现象。所以重新配制显色液继续呈色，第二孵育时间可缩短至4～5min，能提高部分染色强度。
HRP标记时，重复呈色无明显增强效应。通常在显色液中加入0.01mol/l Imidazole 或改用酸性缓冲液（pH5.5～6.0），可提高染色强度；亦可在DAB反应后，1%OSO4浸泡固定5～15min，继之0.4%亚铁氰化钾/0.1N HCl液处理5min，DAB终产物呈黑色，与背景的对比度较佳。另外，在间接法显色较弱时，亦可试用PAP法、ABC法等，探索较合适的染色方法。
2．重复第一抗体在漂洗过程中，结合力弱的抗体易离解丢失，重复应用第一抗体有利于抗体与组织抗原结合，增加抗体数量，提高染色强度（Noorden 1983）。切片经第一抗体孵育后，漂洗，再孵育第一抗体（此时第一抗体可稀释较原工作浓度1至数倍）2～4h，然后经酶标抗体孵育，呈色观察同前。所用抗体为多克隆血清时，提高第一抗体的稀释度，重复孵育2～3次，可得到一定效果。单克隆抗体，经第一抗体—酶标抗体—第一抗体—酶标抗体，也能增加染色强度。
3．双桥PAP法（Vacca 1982） 基本操作与单桥法相似，所不同的是切片经单桥PAP复合物孵育后，漂洗，再孵育桥抗体和PAP复合物（均可稀释1倍），即切片经两次桥抗体、两次PAP孵育—双桥法（Double bridged technique）。据报告，第一抗体用较高稀释度（例单桥法两倍），也能获得与双桥法相近的染色效果。
理论上讲，双桥法是ICC染色中较为敏感的方法，它较单桥法灵敏20～50倍，能够增加抗原的显示数量（25%）和反应终产物的大小。这在研究胚胎发育过程中一些抗原含量较低的组织时，具有一定的应用价值。双桥法可能是通过下列途径提高其敏感性的：①重复的桥抗体与PAP复合物中的抗HRP抗体的未饱和抗原位置结合，再连结另外的PAP复合物，在抗原部位抗体间彼此结合形成较大的抗原抗体复合物，具有多个酶分子（图4-9A），使反应增强。这可能是双桥法敏感性增高的主要机制；②重复的桥抗体与第一抗体未饱和的抗原位置结合，使第一抗体上结合较多的桥抗体及PAP复合物（图4-9B）。但PAP复合物较大，应设法提高其穿透性，达到增加染色强度的目的。
shiyongmianyixibaoyuhesuan031.jpg双桥PAP法的两种放大原理
图4-9 双桥PAP法的两种放大原理
4．半抗原夹层法（Hapten Sandwich Method） 首先用半抗原（FITC等）标记的第一抗体与组织抗原结合，继之用HRP（或ALP）标记的抗FITC抗体与组织抗原结合的FITC的反应，呈色后观察抗原存在部位。FITC为一种荧光色素，荧光显微镜下呈亮绿色荧光，所以也可以同时观察免疫荧光染色结果。FITC特异荧光褪色后，其抗原性仍不丢失，从这种角度讲，荧光抗体法的切片亦能半永久保存。该法较一般间接法敏感性高，最大优点是不管第一抗体来自何种属，只要与FITC连结，均可被同一酶标记的抗FITC抗体识别。避免了准备不同种属的酶标抗体的麻烦，而且FITC标记抗体技术成熟、稳定，商品种类多，容易购买，实验者不妨一试。
第四节 ICC的几种特殊应用
近年 ICC技术在下述方面的应用，令人注目，有着广阔的前景。现介绍如下：
一、ICC在铺片中应用
铺片（Whole Mount Stretch Preparation） 是研究神经分布应用较早、较广的方法。19世纪末，Dogiel和Cajal等利用铺片技术，结合镀银及甲基蓝染色，观察肠道神经丛模式、神经元种类及其相关联的间质细胞。近年来，人们进一步认识到全层铺片技术的优点：例如①不必采用连续切片和三维重建技术，可以直接观察神经元间质细胞的三维结构；②能观察较大区域，在研究显微外科手术后神经分布模式和数量改变中有较好的应用价值；③操作简单，能在较短时间内制作大量标本等。所以，铺片技术在ICC染色中得到广泛的采用（Zhou等1992）
铺片ICC染色方法与切片基本相同，所不同的是铺片较厚，背景着色较强，有时甚至妨碍特异性染色的观察。实验证明，这种非特异性染色主要是酶标抗体/桥抗体与组织γ-球蛋白结合引起的，用封闭性阻断剂及正常血清等分别孵育切片，并在稀释抗体时，加入适量的BSA，可以降低此类非特异性结合。BSA、封闭性阻断剂与IgG（正常血清）的等电点不同，重叠应用，阻断效果尤佳。另外，铺片的细胞膜完整，不利于抗体的穿透，特别是PAP复合物等大分子物质，为此设法提高抗体的穿透性是非常重要的。采用反复冻融和表面活性剂前处理，有助于细胞内抗原的暴露。我们在实验中参考Costa(1980)的制片方法，将组织铺片经系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次10～15min）脱水，Hemo—d 2次（10～15in/次），再水化（100%、90%、70%、50%降酒精）等处理，辅助Triton X-100应用，明显增加抗体的穿透性，获得较为满意的染色效果。 但是，并非所有的组织都能制成铺片，虹膜、肠系膜和小血管等适于制做全层铺片；食道、胃肠道、胆道、胆囊、大血管、输尿管等脏器则均需进行组织分层，再铺片，行ICC染色。
染色方法：以小肠分层铺片为例：
（1）4%多聚甲醛或Zamboni 液固定2～6h，4℃，或丙酮固定。
（2）PBS充分冲洗，置PBS中过夜。
（3）系列酒精脱水，Hemo—D透明，降酒精至PBS。
（4）分层铺片，直接漂浮染色或贴于载玻片风干，再染色。
（5）0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室温，PBS冲洗。
（6）封闭性阻断剂30in，室温，正常兔（羊）血清30min，室温。
（7）第一抗体，孵育，4℃冰箱过夜；PBS2次/2min；重复第一抗体孵育（可稀释1
倍），2～3h，室温，充分使抗体穿透至深层，使组织深层的抗原得以与抗体充分结合。
（8）PBS充分冲洗，2～3h，4℃。
（9）酶标抗体孵育，4℃冰箱过夜。
（10）PBS冲洗，呈色，观察与切片相同。
二、ICC的双重染色法
在某些物质活性检测、神经递质共存的研究、临床肿瘤的分型、定性，以及预后的估测等中，ICC显示了巨大的优势，它不仅能与Carbon、荧光色素、同位素追踪标记及其它组织化学方法（例如PAS染色法）结合，显示两种物质的共存，提示组织细胞的功能，而且本身亦可进行双重染色，研究一些抗原物质的共存，这里仅简单介绍ICC双重染色的几种方法。
（一）切片
1．连续切片（Serial sectioning technique） 连续切片是两种物质共存研究中应用最早的方法之一，是用相邻切片分别孵育两种不同特异性抗体进行ICC染色，主要适用于观察同一细胞内不同抗原的分布。该方法要求切片足够薄，保证每个细胞能同时出现在3～4张相邻切片上，第1和3张切片用相同抗体染色均阳性时，作为阳性结果，可信度较高，可避免结果判断困难。所以，常采用石蜡切片，厚约2μm左右，若用树脂包埋的半薄切片（0.5～1μm），比较容易识别同一细胞内两种抗原的共存。
2．镜影切片法（Mirror sectioning technique） 所谓镜影切片，简单地讲就是两张相邻的石蜡切片（厚2μm）或冰冻切片（厚3～4μm），第二张反转之，贴于载玻片上，同一细胞在两张相邻的切片上呈镜与影的关系（相当于冰冻蚀刻电镜的P面和E面）。分别孵育两种不同抗体，ICC染色，观察其在同一细胞内的分布。
（二）染色
1．ICC与荧光抗体法结合 首先染色显示A抗原，DAB/H2O2呈色，继之用间接（直接）荧光抗体法显示B抗原，于光镜和荧光显微镜下观察，比较两种抗原的分布。因DAB终产物能够沿其表面向周围迁移，尤其是DAB浓度略高、反应时间稍长时，形成的终产物较大，可以遮盖该抗原抗体的反应部位，故两种染色间很少出现交叉反应。该双重染色的方法主要适于显示两种抗原分布不同细胞内，尤其A抗原浓度高、反应较强、DAB终产物较牢固的情况。
2．同一切片的再度染色法（Restanining Method） 用ICC法显示神经递质、神经肽等在神经细胞/神经纤维内共存时，连续切片、镜影切片及重叠染色往往很难判断同一神经纤维的共染，为此建立了同一切片再度染色法。该方法利用4—氯—1—萘酚（CN）产物在酒精内的可溶性及酸处理能使抗原抗体解离的特点，首先第一种抗原用CN发色，染色阳性部位摄影；继之，用低 pH的甘氨酸/盐酸缓冲液（0.2mol/L甘氨酸—盐酸缓冲液，pH2.2～2.3,含0.5mol/l NaCl）或盐酸孵育切片，去除第一次染色的抗体，再经50%、70%、90%、100%酒精脱CN色，PBS洗净后染色第二种抗原，DAB呈色后，摄影比较同一部位是否两种抗原共存在于同一神经纤维。为验证盐酸等处理效果，可省略第二次染色的特异性抗体，仅重复酶标抗体的染色，观察第一抗原阳性部位是否出现重叠着色。
3．同一切片、不同呈色的双重染色ICC法显示A抗原时，用DAB/H2O2呈色，终产物为棕褐色；继之，B抗原染色，CN/H2O2呈色，反应产物深蓝色，光镜下可同时观察两种抗原的局部所在。为避免第二次染色的抗体与第一次染色抗体之间的交叉反应，在B抗原染色前，可用酸性缓冲液处理切片，去除第一次反应的抗体，方法同2。该方法DAB和CN的色彩对比不鲜明，而且HRP酶活性较强，酸性缓冲液中，亦能残存部位活性，所以可能有混合颜色出现，判定同一细胞内两种抗原共存常常有一定难度。
4．两种酶标抗体的双重染色 分别用HRP和ALP标记间接抗体，ICC染色，显示两种不同的抗原。首先显示A抗原，HRP酶标记间接抗体，CN/H2O2呈色；继之显示B抗原，ALP标记间接抗体，FR/As—Mx呈色，轻度甲基绿/苏木精复染细胞核，一般可获得理想的结果，组织结构清晰，色彩对比鲜明。笔者应用此方法，显示小鼠脾脏巨噬细胞标记物ED1、ED2和ED3分布时，得到了较佳的染色效果。尽管该双重染色法应用了不同的酶标抗体，但常用其二者来自同一种属的抗体，所以在第一次染色部位，往往有重叠染色的现象。我们的经验为先染色反应较弱、含量较少的抗原，第一抗体用较高稀释度，酶标抗体则用高浓度（低稀释度），尽量使所有的第一抗体均被饱和，防止其与第二种酶标抗体结合；第二种抗体染色前，应用PBS充分洗净；第二种酶标抗体可用较高的稀释度。这样可避免“非特异”性重叠着色，色彩对比亦较理想。
5．不同种属来源的抗体的双重染色上述几种双重染色法，均系来自同一种属的特异抗体和相同/不同的酶标抗体，所以两次染色间常常有交叉反应。较理想的方法是用不同种属动物制备特异性抗体和两种酶标抗体的双重染色，例如显示A抗原为小鼠单克隆抗体，HRP标记兔抗鼠IgG；显示B抗原为豚鼠单克隆抗体，ALP标记羊（驴）抗豚鼠IgG ，将两种抗体稀释最佳工作液浓度1/2，充分混合、孵育同一张切片，亦可分别染色。CN/H2O2呈色后，FR—As—Mx呈色，光镜下观察两种抗原的分布。该方法两种抗体间无交叉反应，特异性较高，即使细胞内抗原量较少也能发现。但当两种抗原存在同一部位，其中之一浓度较高、占绝对优势时，亦将妨碍另一种抗原的染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。该方法要分别制备4种不同的特异性抗体和酶标抗体，费时费力，实际应用受一定限制。
上述两种双重染色，两种酶标抗体的非特异性着色可能迭加，致使背景着色较单独使用时增强，S/N下降，所以各研究室应根据实验目的和条件，合理选择染色方法为宜。简述染色步骤如下：
（1）切片准备同一般间接法。
（2）切片孵育A抗原，特异抗体1～2h室温。
（3）PBS冲洗，孵育HRP标记抗体45min，室温。
（4）PBS冲洗，孵育B抗原的特异抗体1～2h，室温。充分漂洗，孵育ALP标记抗体，45～60min。
（5）PBS冲洗，Baker’液固定5min，室温，PBS洗净。
（6）呈色CN/H2O2/TBS 15min，室温。
（7）Tris—HCl(pH9.0)冲洗后，Fr AS—Mx呈色8min,37℃。
（8）轻度PBS冲洗，1%戊二 醛固定5min。
（9）水洗，轻度复染细胞核，水溶性封固剂封片。
（10）光镜下观察。双重标记细胞呈暗红至深紫色，与单独阳性细胞有明显区别。
三、ICC在细胞功能研究中的应用
形态学研究目的之一是揭示组织细胞结构特征及其功能意义。利用ICC显示给与细胞增殖标记物，是组织细胞学研究中形态和功能相结合的重要手段之一。目前常用的细胞增殖标记物有4种，Brdu (5—bromo—2--deoxyuridine), DNApolymerase α,PCNA （Proliferating cell nuclear antigen）,Ki—67 等，相对应的4种单克隆抗体均有商品出售。因组织细胞内无内源性Brdu存在，所以Brdu应用较广。Brdu为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。
笔者在观察大鼠小肠上皮细胞增殖、代谢时，一次腹腔注射Brdu（Sigma）4mg/150～200g体重，分别在给药后1h和1、2、3、5、7天取小肠，应用抗Brdu抗体，ICC染色，可见肠上皮细胞从肠腺至绒毛顶端增生移行。在计数免疫活性细胞研究中，一次注射Brdu后，计数瞬间进入S期细胞数或连续多次注射Brdu，计数注射Brdu期间进入S期细胞的总和。另外在临床上，术前或术中给与Brdu，判断脑肿瘤细胞分化程度、恶性度等亦较常用。
掺入双链DNA内的Brdu，以氢链与腺嘌呤结合，不能直接与抗Brdu抗体反应，需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等，使DNA双链部分单链化，抗Brdu小鼠单克隆抗体与增殖细胞核内的Brdu结合，再经酶标抗小鼠IgG抗体孵育、呈色，显示进入S期细胞的情况。
盐酸和蛋白酶处理等可引起其它抗原或组织形态发生变化。为此，Conchoroff(1985)等制备了一种单克隆抗体（Bu—1），其培养液上清能与双链DNA的Brdu反应，因为培养液上清中含有DNA酶，可分解双链DNA，显露Brdu，达到染色目的。笔者采用戊二醛固定后，胃蛋白酶—盐酸处理，亦得到了良好的染色结果。简述染色步骤如下（Matsuna,1989）：
（1）冰冻切片/石蜡切片准备同前。
（2）TBS冲洗，Baker’s液固定10min，室温。
（3）TBS冲洗，1%戊二醛固定5～10min，室温。
（4）双蒸水冲洗，0.006%(冰冻切片)或0.02%(石蜡切片)胃蛋白酶/0.01mol/l HCl,37℃，10min。
（5）双蒸水冲洗，4N HCl 30min，室温。
（6）PBS充分冲洗，使切片pH回至中性。
（7）封闭性阻断剂20min，室温。
（8）抗Brdu抗体孵育1～2h室温或4℃过夜。
（9）PBS冲洗，HRP标记抗小鼠IgG抗体45min，室温。
（10）PBS冲洗，DAB/H2O2呈色。
（11）轻度苏木精复染，脱水透明，封片同前。分裂增殖细胞核呈棕褐色。
采用双重或多重染色、观察何种细胞分裂增殖时，首先应染色其它抗原物质，最后显示Brdu。通常在第一种抗体呈色后，再经1%戊二醛固定5～10min，重复上述程序，均可获得较满意的染色结果，分裂细胞核呈棕褐色；显示其它抗原用ALP标记抗体，则细胞浆为红色（FR）或蓝色（FB）。
四、 ICC在原位杂交技术中的应用
传统的ICC法主要用于检测组织细胞中含有何种物质，根据该物质的作用，推测其组织细胞生理、病理意义。但该物质来自何处，是否是阳性细胞合成往往较难判断，结合免疫电镜及双重染色等方法，在某种程度上，有助于推断该物质的来源。然而通常ICC法显示的是组织细胞已经合成的物质（过去时），本身不能说明阳性组织细胞目前的功能状态，亦无法预测细胞将合成何种物质，发挥什么功能，因此，单纯的ICC法存在着被动性。
近年来，ICC法与原位杂交技术结合，使细胞内活性DNA可视化，直接显示某染色体上，何种基因活性化或非活性化，描述组织细胞现在的状态，同时亦可预知未来组织细胞将合成何种物质，发挥哪些功能等，直接观察组织细胞的时空改变，这在病理生理研究中有着重要意义，为形态学研究开辟了令人瞩目的前景。
众所周知，机体内不同的蛋白质发挥其特定的功能，与其氨基酸序列密切相关，而它的氨基酸序列又是DNA通过mRNA转录控制的。因此检测该DAN/mRNA的分布，可判断组织细胞的功能状态。为在组织细胞水平检测DNA/mRNA等一定碱基序列的核酸存在与否，Gall（1969）等建立了原位杂交方法（详见第二十章 ）。
在检测某种特定的蛋白质在哪一类细胞内合成时，常常应用连续切片或镜影切片，原位杂交法显示合成该蛋白质的mRNA，ICC法染色其蛋白质抗原，二者存在于同一细胞时，具有较强的说服力。同一切片进行上述双重染色时，原位杂交步骤中，大多数抗原物质的抗原性往往易被破坏，所以最好在ICC染色后再进行原位杂交染色。ICC染色中，抗体内含有RNase等可能破坏细胞内的mRNA，为此应选用精制IgG抗体，并加入500u/ml肝素抑制RNase。肝素系酸性多糖，其化学性质与核酸类似，能够与以核酸为底物的酶（RNase）结合，从而保护mRNA免受破坏。另外，ICC染色以DAB呈色时，核酸探针易吸附于DAB产物上，需注意。
近年随着细胞工程的进步，ICC、原位杂交技术将在细胞生物学、组织学、遗传学、病毒学、临床疾病诊断等各个领域，得到更广泛地应用。
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