章节内容
第一节 免疫金技术发展史
早在一个世纪以前，化学家就对胶体金进行了研究，当时只是研究它的结构和金属性质。在1939年Kausche和Ruska把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察见金离子呈高电子密度。然而胶体金技术作为标记物应用于免疫组织化学研究是在1971年，Faulk 和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。此后，他们还把胶体金与抗胶原血清，植物血凝素，卵白蛋白，人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。1974年Romano和他的同事们将胶体金属标记在马坑人的IgG上，实现了间接免疫金染色法。1974年Bauer等报道凝集素—金复合物的应用。1978年Geoghe－gan等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原。1981年Danscher建立了用银显影液增强光镜下金颗粒可见性的免疫金银染色法（Immunogold—sliver staining, IGSS）。到了1986年Fritz等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色，使得结果更加鲜艳夺目。胶体金技术逐渐得到完善和成熟，近１０年来此项技术得到了迅速发展和广泛应用。应用胶体金为标记物的免疫金染色（IGS）与免疫金银染色（IGSS）方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记同时观察细胞和组织结构，可以定性，定位以至定量研究。目前它已被应用于医学和生物学研究的众多领域。
第二节 溶胶的基本概念
一、胶体金
即金的水溶液，它也具有一般溶胶的特性。分散体系的分类：体系就是一定空间范围内作为我们研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系叫做分散体系。被分散相质点的大小而改变，因此，按分散相质点的大小不同，可将分散体系分为三类。
（一）离子分散体系
指分数散相以小分子或离子状态分散着。这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从溶液中分离出来。
（二）胶体分散体系
是指分散相颗粒在1～100nm之间的分散体系叫做胶体分散系。胶体溶液外观透明不浑浊，在普通显微镜下看不见它的分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离沉降，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。
（三）粗分散体系
分散相颗粒是由许多分子组成，因粒子较大，用肉眼或显微镜即可看见，不稳定，极易因重力而自动沉降，外观浑浊不透明。
二、胶体金的一般性状
（一）胶体金的颜色
溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线和种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短，对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，20～40·nm之间吸收波长530nm，液体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。
（二）胶体金的稳定性
溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散系之间，溶胶的颗粒作布朗运动，不易受重力影响下沉。然而溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总表面积较大，当胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。胶体颗粒变大以致超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响溶胶稳定性的主要原因有三点：①胶粒间的相互吸引力。当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。②胶粒及其溶剂化层（溶剂是水就是水化层）的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。③胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。
（三）溶胶的聚沉现象
胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶颗粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶颗粒带电量减到很小甚至中和；其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
1．少量电介质对溶胶的聚沉作用 少量电介质即可使溶胶聚沉，但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表示，聚沉值愈小，聚沉能力愈大，聚沉值从实验中得出如下的离子价规则：①电介质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用。②同价离子聚沉能力几乎相等，不同价离子的聚沉能力随离子价的增加而显著增加。电介质为什么能使溶胶聚沉呢？这是由于电介质与胶粒带相反电荷的离子的作用，中和了胶粒所带的一部分电荷，使胶粒电荷量减少，扩散层缩小，溶剂化层变薄，而当双电层厚度缩至很小的溶剂化层变得很薄时，两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力，两个胶粒间因引力加大而合并的趋势增强，甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉。胶粒的双电层结构见图5-1。
shiyongmianyixibaoyuhesuan032.jpg胶粒的双电层结构示意图
图5-1胶粒的双电层结构示意图
2．温度对溶胶稳定性的影响 一般影响不大，当温度升高时，吸附能力减弱，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加。
3．浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉，所以制备比较稳定的溶胶，要有一定的合适浓度。
第三节 胶体金的制备方法
胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。
一、制备胶体金的准备
（一）玻璃器皿的清洁
制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液，用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
（二）试剂的配制要求
（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。
（3）白磷或黄磷乙醚溶液的配制：白磷在空气中易燃烧，要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块，放在滤纸上吸于水份后，迅速放入已准备好的乙醚中去，轻轻摇动，等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内，放在阴凉处保存。
二、制备胶体金的方法和步骤
（一）白磷还原法
| 还原次数 | 颗粒直径（nm） | 正负误差 |
| 1 | 5.6 | 0.9 |
| 2 | 6.7 | 0.9 |
| 3 | 7.9 | 0.9 |
| 4 | 9.8 | 1.3 |
| 5 | 12 | 1.0 |
（二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/l K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。
（2）在搅拌下加入1ml0.7%抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。
（3）加双蒸水至100ml，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8～13nm。
（三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）
| 0.01%的HAuCl4（ml） | 1%柠檬酸三钠(ml) | 直径（ml） |
| 100 | 5.0 | 10.0 |
| 100 | 4.0 | 15.0 |
| 100 | 1.5 | 25.0 |
| 100 | 1.0 | 50.0 |
| 100 | 0.75 | 60.0 |
| 100 | 0.60 | 70.0 |
| 100 | 0.42 | 98.0 |
| 100 | 0.32 | 147.0 |
| 100 | 0.25 | 160 |
（四）鞣酸—柠檬酸三钠还原法（Slot与Gueeze1985年）
| A 液 | B 液 | |||||
| 直径（nm） | 1%柠檬酸钠（ml） | 0.1mol/L K2CO3ml | 1%鞣酸（ml） | H2O（ml） | 1%HAuCl4（ml） | H2O（ml） |
| 3.3 | 4 | 0.2 | 4 | 11.8 | 1 | 79 |
| 5 | 4 | 0.2 | 0.7 | 15.1 | 1 | 79 |
| 10 | 4 | 0.025 | 0.1 | 15.875 | 1 | 79 |
| 15 | 4 | 0.0025 | 0.01 | 15.987 | 1 | 79 |
（五）乙醇超声波还原法（Baigent and Muller 1980）
（1）1%HAuCl4水溶浓0.2ml加入100ml双蒸水。
（2）用0.2molK2CO3调pH至中性，再加入1ml乙醇。
（3）用20KC、125w超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，由此法制得的胶体金颗粒为6～10nm。
（六）硼氢化钠还原法（Tschopp et al 1982）
（1）将预冷在4℃的40ml双蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。
（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。
（3）在搅拌下，迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重复加入3～5次，直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌5min，获得的金颗粒直径在2～5nm之间。
（七）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01%HAuCl4上水溶液100ml，加热至沸腾。
（2）加入40μl195Au。
（3）迅速加入4ml1%柠檬酸三钠水溶液，5～7min出现透明的橙红色。
（4）其含量为I×106脉冲数/min。
（八）微波制备液体金方法。
第四节 胶体金的质量鉴定
胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才能应用。
一、胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内，取现放在空气中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射电镜下观察，主要观察金颗粒的大小，符合不符合所需要的颗粒直径，金颗粒是否均匀一致，有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在，还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。
二、胶体金金颗粒均匀度测定
一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差，前者反映颗粒的大小，后者说明颗粒是否均匀一致。
三、影响胶体金颗粒大小的因素
如果有较多的大小不等的金颗粒及有椭圆形，三角形金颗粒存在应重新制备。一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入，而是多次加入。再者搅拌不均匀，速度太慢没有搅拌起来，造成了颗粒大小不等。制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备了合格的胶体金以后，放在室温或4℃保存。避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。冰箱内半年左右。根据胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在20天以内进行标记。
第五节 胶体金标记物的制备
胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果＝低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作稳定剂。用Sephacryb S—400 （丙烯葡聚糖S—400）层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以BSA作稳定剂者。
一、待标记蛋白质的准备
（1）透析除盐：蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/l NaCl , pH7.0）透析。
（2）去除蛋白质中的沉淀：长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以100000r/min 4℃离心60min取上清液，调整蛋白质浓度至1mg./ml即可用于标记。
二、胶体金pH值的调整
| 蛋白质 | pH |
| 抗体（γ球蛋白） | 9.0 |
| 亲合层析的IgG | 7.6 |
| 单克隆抗体 | 8.2 |
| F（ab＇）2 | 7.2 |
| SPA(葡萄球菌蛋白) | 6.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅰ | 8.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅱ | 8.0 |
| 花生凝集素 | 6.3 |
| Helix pomatia lectin | 7.4 |
| 大豆凝集素 | 6.1 |
| Lens Culinaris lectin | 6.9 |
| Lotus Tetragonolobus lectin | 6.3 |
| 荆豆凝集素 | 6.3 |
| Bandeirae simplicifolia lectin | 6.2 |
| 过氧化物酶 | 8.0 |
| 类卵粘蛋白 | 4.8 |
| 血浆铜兰蛋白 | 7.0 |
| α-胎球蛋白 | 6.5 |
| 小牛血清白蛋白 | 6.5 |
| 牛血清白蛋白 | 5.5 |
| 牛血球白蛋白结合肽 | 4.5 |
| 牛血清白蛋白结合胰岛素 | 5.3 |
| 霍乱毒素 | 6.9 |
| 破伤风毒素 | 6.9 |
| DNAase | 6.0 |
| RNAase | 9.0 |
| 低密度脂蛋白 | 5.5 |
| α2-巨球蛋白 | 6.0 |
| 抗生物素蛋白（亲合素） | 10.0 |
| 链霉抗生物素蛋白 | 6.6 |
| 麦胚凝集素 | 9.9 |
三、待标记蛋白质最适稳定量的测定
| 管数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 胶体金（ml） | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 蛋白质（μg） | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 0 |
| 10%NaCl(ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
四、蛋白质的胶体金标记
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：
（1）根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量。
（2）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH），加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。
（3）在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA）使其终浓度为1%，或加入3%聚乙二醇（PEg MW20000）使其终浓度为0.05%, 我们对比了BSA和PEG稳定胶体金的效果，BSA稳定的标记胶体金，放在4℃达2年半仍然保持良好性能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4℃1年左右就有分层现象，而且染色效果显著下降。因此，我们认为最好还是用BSA作稳定剂。
（4）将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的1/10量，浓缩完毕后纯化。离心法纯化时，不要浓缩。
五、胶体金标记蛋白质的纯化
标记好的免疫金探针必须经过纯化处理以后才能用于免疫细胞化学染色。纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。
（一）调整与超速离心法
| 胶体金颗粒直径（nm） | 蛋白质 | 时间（min） | 转速（r） |
| 3.0 | GAR IgG | 60 | 30000 |
| 5.0 | GAR IgG | 50 | 25000 |
| 10.0 | RAM IgG | 50 | 19000 |
| 15.0 | SPA | 40 | 17000 |
| 15.0 | ALcc IgG | 40 | 17000 |
| 20.0 | SPA | 40 | 13000 |
| 25.0 | SPA | 35 | 12000 |
| 胶体金颗粒（nm） | pH | 蛋白质 | 转速（xg） | 时间（min） |
| 5 | 9.0 | 羊抗人IgG | 45000 | 45 |
| 10 | 8.2 | 抗胃癌单克隆抗体 | 45000 | 30 |
| 15 | 6.5 | 链霉亲和素 | 12000 | 45 |
| 20 | 6.0 | SPA | 12000 | 30 |
| 胶体金颗粒大小（nm） | OD（520）nm |
| 5 | 2.5 |
| 10 | 2.5 |
| 15 | 3.5 |
| 20 | 5.0 |
（二）凝胶过滤法
为纯化免疫金探针的最好方法，其特点是简便，过滤的胶体金颗粒比较均匀，不容易凝集，而离心方法转速高，时间长，胶体金颗粒沉淀容易凝集，用凝胶过滤克服了这一弱点。选用本方法时胶体金溶液必须用牛血清白蛋白作稳定剂。具体操作过程如下：
（1）将浓缩好的胶体金以1500r/min离心去掉大的聚合物。吸出上清待过柱。
（2）柱高34cm,直径1cm,加样体积为柱床体积的1/10。
（3）丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls—400, Pharmacia, Sweden）装柱后用0.02mol/lpH8.2TBS平衡层析柱（pH7.4者用于标记的SPA），平衡好后，吸取上清胶体金液体加入层析柱内，加样时请注意不要破坏S—400的界面。
（4）用0.02mol/lpH8.2 TBS洗脱，先行滤出的液体有少量微黄不透亮的液体，紧接着是浓度高红色而透亮的胶体金，注意颜色的变化，如红色变淡，变黄立刻停止收集。如Sephacryls—400没有，也可以用Sepharose –4B或6B代替（Pharmacia,Sweden）也能收到较好的效果。
六、免疫金探针的鉴定
（1）用有Formvar 膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后醋酸铀复染，在TEM下观察，可见金颗粒周围有一明显的空晕，表示颗粒表面吸附有蛋白质分子。
（2）纯化后免疫金探针是否保持很好的生物学活性是判断其质量好坏的主要指标，因此，在使用之前必须对它的特异性，敏感性进行鉴定。鉴定举例，用阳性抗原片，脱蜡至水，胰蛋白酶消化，加第一抗体（多克隆或单克隆），一般过夜再加标记抗同一抗特异性抗体结合的胶体金溶液（多克隆或单克隆抗体标记的胶体金）详细方法步骤见后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀释SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀释，37℃45min，冲洗，显色，观察结果，染色效价以阳性结果明确，背景浅的稀释度为标准。免疫细胞化学染色试验可以较全面地反应免疫金探针的质量。
第六节 免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择
免疫胶体金银染色和其它免疫细胞化学方法一样，要想得到好的染色效果，关键取决于标本处理是否合适，只有使抗原性及组织结构保存的好，才能使以后的染色成功成为可能，其次要用高特异性和高效价的一抗，选择合适的稀释度。由于免疫组化方法广泛应用于不同的生物学科，所要检出的抗原种类繁多，性质也各不相同。因此，不可能有一种适用于所有抗原的固定剂，而是根据不同的抗原性质区别对待。根据我们使用的固定剂介绍如下，供参考。
一、固定剂的选择及固定时间（详见表5-9）
| 待检抗原 | 固定剂的种类 | 固定时间 |
| 蛋白质 | ||
| 酶 | 冰冻切片不固定，或用95%乙醇，B5固定液 | 10 min |
| 激素 | 冰冻切片，涂片，印片，不固定或丙酮，甲 | 10 min |
| 醇，乙醇，PEG固定，B5固定液固定 | 4℃30 min | |
| 免疫球蛋白 | 中性福尔马林，四氯化碳（1%甲醛） | 30 min |
| 白蛋白 | 95%乙醇含1～5%冰醋酸 | 30 min |
| 纤维蛋白元 | 同上 | 30 min |
| 病毒 | 丙酮，100%乙醇，甲醇，乙醚 | 30 min |
| 糖蛋白 | PLP，丙酮 | 30 min |
| 脂质Forssman | 中性福尔马林 | 20 min |
| 抗原 | 2.5%硫代硫酸钠，冰冻切片不固定 | 20 min |
| 免疫电镜 | PLP，戊二醛，戊二醛—多聚甲醛（Kacnovsky’s 液pH7.3）PEG、ECD-G等 | 30min |
二、切片的处理与粘附。
免疫组化染色过程较长，洗的次数很多，而且均在振荡洗涤，抗原片附贴不紧，往往在最后的时刻，还没有等显色就会脱落导致前功尽弃，这个环节 虽小却会影响大局，因此，为了保证切片染色成功必须把切片处理好，解除掉片的后顾之忧（方法见第一章 ）。
第七节 光镜免疫金银细胞化学方法
一、免疫金染色
（一）免疫金法（IGS）
1987年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS）。IGS的特点是染色程序简便，不要显色，就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm，并且用的浓度较高。用IGS定位细胞抗原时一般都采用间接法，下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明IGS的步骤：
（1）石蜡切片→脱蜡至水。
（2）0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3）用双蒸水振洗5＇×2。
（4）用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（5）1%卵蛋白（EA）封闭10min。
（6）稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀释），4℃过夜。
（7）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（8）1%EA封闭10min。
（9）0.02mol/l TBS pH8.2 稀释兔抗鼠金标抗体（1：8）37℃45min。
（10）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（11）双蒸水振洗5＇×2。
（12）1%戊二醛，10min。
（13）双蒸水5min 。
（14）用苏木素衬染核1min，甘油封片。
结果：在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有HBsAg定位在细胞浆内。
（二）蛋白A-金（PAG）放大法
为了得到更明确的染色结果，在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法，使IGS得到放大，这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法。
（1）石蜡切片→脱蜡至水。
（2）1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（4）1%EA封闭组织10min。
（5）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体（1：1000）4℃过夜，或者37℃1h。
（6）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（7）1%EA封闭10min。
（8）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG（1：40），37℃1h。
（9）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（10）1%EA封闭10min。
（11）抗A蛋白抗体（1：100）37℃。45min。
（12）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（13）加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG（1：40），37℃45min。
（14）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（15）双蒸水振洗5min。
（16）1%戊二醛10min。
（17）双蒸水振洗5min。
（18）0.01%伊文思蓝2min，甘油封片。
光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加深，阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合，因此，与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图5-3。
shiyongmianyixibaoyuhesuan034.jpgPAG放大法原理
图5-3 PAG放大法原理
PAG放大法的优点：①使用试剂单一；②可大大提高IGS的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。
二、免疫金银法
1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法（Immunogold—sliver staining, IGSS）IGSS的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ago）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终抗原位置得到清楚放大。请参见图5-4。
shiyongmianyixibaoyuhesuan035.jpg 用银增敏示意图
图5-4 用银增敏示意图
（一）石蜡切片的IGSS染色
以人肝细胞内HBsAg定位举例说明。
（1）切片常规脱蜡至水。
（2）Lugol＇s液，5min.
（3）5%硫代硫酸钠水溶液脱碘5min。
（4）用双蒸馏水冲洗干净。
（5）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。
（6）用0.1%胰蛋白酶消化10min或用3mol/L尿素消化20min。
（7）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min一次。
（8）1%卵白蛋白封闭15min。
（9）马抗HBsAg抗体1：1000稀释，37℃1～2h 或4℃过夜。
（10）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。
（11）1%卵白蛋白封闭10min。
（12）1：40，PAG，37℃45min。
（13）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。
（14）双蒸水洗5min，两次。
（15）物理显影见后所述。
（16）双蒸水洗5min，两次。
（17）苏木素衬染。
（18）酒精常规脱水，透明，封固。
结果，光镜下见肝细胞胞浆内有膜或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。
（二）冰冻切片的IGSS染色
作冰冻切片的组织，若在动物试验可以先经过固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰冻切片。人的组织也可通过浸泡固定或不固定，这主要根据保存抗原性的需要而定。固定过的组织可用20%蔗糖PBS（0.01mol/l pH7.2）浸泡2～4h或在切片时用OCT包埋，以减少冰冻切片过程中冰晶的形成。如果切片还准备用于电镜包埋，则可经过5%，10%，20%浓度逐级递增的蔗糖溶液。在冰冻切片前，可先入氟里昂–22 （Freon--22）骤冷，这样可使组织的结构保存更好，适用于电镜观察。
（1）冰冻切片。
（2）Lugol＇s液，5min.
以下步骤同人肝HBsAg的染色方法。
（三）半薄切片的IGSS染色
IGSS染色的半薄切片，可以在光镜下直接观察阳性结果，为电镱取阳性部位及观察打下良好的基础。环氧树脂会妨碍免疫组化染色。经过饿酸处理后固定的组织同样也会影响抗原抗体反应，因此，半薄切片作IGSS染色剂，应作以下处理。
（1）脱环氧树脂，切片以NaOH的无水乙醇饱和溶液浸泡30～60min，然后以无水乙醇洗5min，两次，再以95%，80%，70%酒精各洗5min，然后入水。
（2）经饿酸固定过的切片入1%过碘酸10min（0.5μm厚，时间可随切片厚薄增减）除去饿酸，然后蒸馏水洗5min，4次。
（3）切片用0.05mol/l TBS,pH7.4洗10min。
（4）按石蜡切片第二步往下进行。
三、彩色免疫金银法（CIGSS）
彩色免疫金银法（coloured IGSS简称CIGSS）是在IGSS基础上发展起来的一种新方法。其基本原理与彩色显影相似。IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂相接触立即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以不与组织发生非特异性吸附。
以彩色显影人肝组织内HBsAg的操作过程为例：
（1）脱蜡至水。
（2）0.1%胰蛋白酶37℃10min。
（3）Lugol＇s,碘液5min。
（4）5%硫代硫酸钠1min。
（5）用0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，两次。
（6）1%卵白蛋白封闭10min。
（7）马抗HBsAg抗体1：1000稀释，37℃1～2h 或4℃过夜。
（8）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，两次。
（9）1%卵白蛋白封闭10min。
（10）PAg 1：40，37℃45min。
（11）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，两次。
（12）双蒸水洗5min，两次。
（13）物理显影（见P116页物理显影配方）。
（14）自来水冲洗。
（15）双蒸水洗5min，两次。
（16）2%铁氰化钾和1%溴化钾，1min。
（17）双蒸水冲洗。
（18）彩色显影（α-萘酚或菲尼酮）2min。
（19）双蒸水冲洗。
（20）2%铁氰化钾和1%溴化钾，1min。
（21）2%铁硫代酸钠和1%亚硫酸钠，5min。
（22）流水冲洗。
（23）如需要可用苏木素或核红复染。
（24）缓冲甘油封固，观察。
结果：CIGSS的优点：①阳性结果比黑色更鲜明;②可以使弱信号得到放大;③消除IGSS背景染色;④信号/背景比值高;⑤是开展免疫金银双标技术的新途径.光镜下见HBsAg阳性物质呈鲜艳的蓝色(α-萘酚为成色剂)或呈绿色(菲尼酮为成色剂)。背景干净，阳性结果清楚。
四、免疫金及免疫金银技术的优点
免疫金银技术（Immunogold—sliver Technique）是在免疫金基础上发展的新兴的先进的免疫细胞化学检测技术，它比免疫荧光，免疫酶标技术有许多独特的优点。
1．制备方法简单，易行。
2．标记简单抗体、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通过物理吸附作用与胶体金颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于在标记过程中不需要经过任何化学方法交联，抗体的生物活性可保持不变，标记方法简单容易。
3．适用范围广 胶体金银技术既能用于光镜也能用于透射及扫描电镜，同时还可用于X线能谱分析。在荧光显微镜上添置一块特制的滤板（IGs filter block）还可直接对胶体金颗粒进行观察，金颗粒在荧光显微镜下呈现明亮的点状物，定位准确，敏感性高，标本可长期保存。
4．特异性强免疫金探针的非特异性吸附作用小，较少受生物组织背景因素的影响，在抗原或抗体的检测中显示出高度的特异性。
5．敏感性高由于金颗粒的电子密度很大特别适合透射电镜及扫描电镜，因此，免疫金银法用于电镜，其检测抗原或抗体率远远超过酶反应物，从而大大改进了免疫细胞化学技术在电镜水平上的分辨率。光镜下金颗粒经过银显影后得到放大，用于检测组织细胞抗原时其敏感性比PAP法高200倍。我们检测肝炎表面抗原时比ABC法高6倍，是至今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适合于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。
应用彩色IGSS和IGSS双标及多标记，可在同一张切片上检测两种以上的抗原成份。胶体金可以制备成不同大小的颗粒，将不同直径的胶体金分别标记不同的抗体或抗原，可以在同一张标本上同时区分出两种或两种以上的抗原或抗体，非常适用于电镜水平的双标和多标记，为研究细胞内抗原及多种抗原的表达及各种抗原分子相互之间的关系等提供了最佳手段。
免疫金银技术是新兴的科学技术，目前许多实验室越来越广泛地采用这一新技术，从而使它的发展有了扎实的基础。用免疫荧光、免疫酶技术、放射免疫技术可做的工作，均可使用免疫金银技术。另外，这一新的方法在其它技术的配合下不断地得到更新与进步，使它能经常增添新的内容，特别是免疫金和胶体金示踪作为一门独特的新技术将在生物医学及其它领域的研究中发挥着越来越大的作用。
五、在IGSS染色中常见技术问题和对策
（一）背景染色产生的原因和防止方法
（1）第一抗体或金标抗体稀释度不合适，一般容易犯抗体使用过浓的毛病，认为抗体越浓越好，结果适得其反。应该先作方阵滴定，优选最佳稀释倍数（见第一章 ），即可避免非特异性染色，又可节 省抗体。
（2）使用正常箅清封闭和在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白，可以减少非特异吸附，降低背景染色。
（3）显色的器皿必须彻底清洗，化学试剂必需用三蒸馏水配制。
（4）乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应。醋酸银则可在有光的环境中显色。
（5）显色时切片应垂直放置在银显影液中，使过多的银颗粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。
（6）控制反应时间，显影液加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在切片上。一般加入明胶1%～2%，效果比较满意，反应时间根据室温而定，室温25℃左右显色时间10～15min，室温在20℃以下，显色时间20～30min左右。
（7）洗涤：使用TBS时最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白，防止出现背景的非特异染色。
（二）背景染色已发生应如何消除
（1）2%硫代硫酸钠，1%铁氰化钾等量混合，加在切片上至背景无色为止。
（2）2%铁氰化钾和1%溴化钾等量混合作用1min水冲洗，然后加上2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色，至背景干净为止。
（3）0.1%重铬酸钾加0.25%浓硫酸，在显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景为止。然后用5%硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长，以免阳性结果被脱掉。
（4）用0.3%～1%的H2O2处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱水时间，防止把阳性结果脱色。
（三）彩色显影背景过染的处理方法
彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理。
（1）纯酒精滴到切片上3～5s,立即冲掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不彻底，造成阳性结果脱色。
（2）75%的酒精滴到切片上1min，立即冲掉，脱色不能时间过长，过长后阳性结果全部脱掉。
六、物理显影液及缓冲液的配制
（一）缓冲液的配制
（1）0.05mol/l pH7.4 TBS 配制
Tris（三羟甲基胺基甲烷）12.1g
NaCl 17.5g
加双蒸水1900ml
然后用浓HCL调至pH为7.4再加双蒸水至2000ml
Tris 4.84g
NaCl 17.5g
BSA 2.0g
NaN31.0g
双蒸水1900ml,充分搅拌至溶质完全溶解,用浓HCl调pH至8.2,再加双蒸水至2000ml。
（二）银显影液的配制
1．乳酸银显影液的配制：混合以下溶液
①10%阿拉伯胶水溶液60ml
②枸橼酸缓冲液pH 3.5 10ml
③对苯二酚1g,加双蒸水20ml溶解。
④乳酸银水溶液100 mg加水10ml。
注意在暗处显影。
2．硝酸银显影液的配制
①10%阿拉伯胶水溶液60ml。枸橼酸缓冲液ph 3.5 10ml
②对苯二酸1.7g水溶液30ml。
③硝酸银40mg水溶液2ml。
①②两溶液完全溶解，临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。
4．彩色显影液的配制
①0.2N氢氧化钠的异丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚（或菲尼酮）。
②500mg碳酸钠，25mg溴化钾，50mg亚硫酸钠，加双蒸水25ml。
①②两液1：10混合，室温下彩色显影。
5．醋酸银显影液
①15%阿拉伯胶60ml，柠檬酸缓冲液10ml，pH3.5。
②对苯二酚1.7g溶于20ml蒸馏水中。
③醋酸银100mg溶于蒸馏水10ml中。
用前①②③依次混合，不需要避光，在室温下显影。
（三）柠檬酸缓冲液的配制
柠檬酸（C6H8O7.H2O）25.5g
柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O）23.5g
加重蒸水100ml溶解即成，pH3.5
(四)氢氧化钠（NaOH）无水乙醇饱和溶液的配制
8g氢氧化钠，加入100ml无水乙醇振摇溶解即成。
第八节 免疫胶体铁细胞化学
胶体铁（Ferric Colloid）是一种阳离子胶体，可通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小及电子密度，最初被用于光镜及电镜下定位组织中的阴离子部位（Hale,1946Seno,etal, 1983,Murakami， et al 1986）。1989年日本学者Seno等在抗体分子上标记了胶体铁，将胶体铁引入免疫细胞化学技术（Seno,et al. 1989）。杨守京等在胶体的制备方法及其标记物的纯化等方面做了改进，成功地用于流行性出血热病毒抗原的检测（杨守京，等，1992）。该方法具有较高的特异性与敏感性，背景染色干净。
一、胶体铁的制备方法
早期制备的胶体铁作为阳离子胶体是用于检查组织中阴离子的定位，其制备主要是通过三氯化铁（FeCl3）的煮沸完成的，如有：（1）FeCI3直接煮沸（Hale ,1946）:(2)FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混和液中（Rinehart,1951）:(3)FeCl3倒入煮沸的二甲坤酸钠溶液中（Seno.et al,1983）。或FeCl3与二甲砷酸溶液一起煮沸（Seno ,et al.1985）其后，制备方法不断改进，1986年Murakam 等用水合联胺二甲砷酸-FeCl3煮沸法制备出微细颗粒胶体铁（Fine-granular cationic iron colloid）,胶体颗粒小（0.5～1nm）,从而使其稳定性及穿透能力大大增加(Murakarmi,et al.1986)。用二甲砷酸代替二甲砷酸钠也可以获得同样胶体，具体步骤如下：在60ml 0.1mol/LFeCl33ml，将混合物加热煮沸至变成深棕红色为胶体砷酸铁。室温冷却后，再以二倍于原体积的0.1mol/LpH7.4的二甲砷酸钠缓冲液（Cacdylate sodium Buffer pH7.4,CB）稀释，即可进行抗体标记。该方法制备的铁胶体呈深红色，颗粒大小1nm左右，在pH4～8范围内稳定，4℃可存放一个月以上，室温存放半个月，阴离子定位分布同Murakami等的胶体铁，与IR-COO-有较强的亲和力，但不与IR-NH+结合。
二、抗体的标记和纯化
胶体铁的等电点为7.8至7.9,在pH7.4时通过离子键能与抗体IgG(pH5.8～7.3)结合而不影响抗体活性,在此条件下,Seno＇对Hale＇胶体铁进行了抗体标记,并成功用于免疫细胞化学染色(Seno,et al.1989),抗体标记时,用0.1mol/L碳酸钾将胶体的pH调至7.4按每毫升脱体铁0.2～1mg的蛋白量,将IgG在电磁搅拌下逐滴加入到胶体铁,搅拌5min后,通过CB平衡的Amber liaht CC-50层析柱,CB洗脱纯化.作者在胶体铁的制备方法进行了改进,吸收了Murakami等胶体的优点,所制备的胶体铁,颗粒小,稳定性高,其pH值近中性,标记效果好,CM-sephadex C-50(Pharmacia)可取代Amberlight CG-50用于纯化标记抗体(杨守京,等,1992)。
三、胶体铁标记抗体的鉴定
用免疫斑点法或免疫细胞化学染色等方法可鉴定抗体的标记效果
1．免疫斑点法 在处理好的硝酸纤维素膜上分别滴加100～10-7系列稀释的抗原，斑点直径0.25cm, 空气中干燥，80℃多聚甲醛蒸气固定1h，然后分别以胶体铁标记的抗体一步法或用桥抗联接胶体铁标记物的间接法染色，普鲁士蓝呈色观察。一步法所难检测到的抗原量为10-２～10-３μg,间接法 敏感性至少增加10倍（10-３～10-４μg）。
2．免疫细胞化学染色法 步骤同下，方法敏感性同免疫金银法（IGSS），优点是背景干净。
四、免疫胶体铁细胞化学染色
（1）组织切片脱蜡入水，0.01mol/l pH7.4 PBS洗；
（2）用4%正常羊血清封闭组织37℃ ，30min。
（3）分别以第一抗体孵育组织，4℃24h，PBS振洗10min×3；
（4）用胶体铁标记的第二抗体37℃孵育30min或用桥抗联接胶体铁标记物；
（5）蒸馏水洗；
（6）以1%的亚铁氰化钾与1%盐酸混合液显色20in；
（7）自来水洗 ；
（8）核固红染核，脱水，透明、封片。
以该方法染色，阳性为蓝色，胞核为红色。
五、方法的应用
胶体铁的呈色产物亚铁氰化铁是一络合物（解离常数1×10-35），一经形成，难以再与其它化学物质发生反应。蓝色的亚铁氰化铁与棕色的DAB产物及黑色的银颗粒颜色对比明显，因此强结合免疫酶及IGSS进行光镜下抗原的双标及多标记。胶体铁（颗粒1nm）标记抗体直径比常用胶体金（5～40nm）及铁蛋白标记抗体（12nm）小，因而对固定组织具有更好的穿透力，可用于抗原的超威结构定位，尤其是免疫电镜的包埋前染色。结合免疫酶及不同大小胶体金标记抗体，还可用于抗的双标记及多标记。
非特异性背景染色是免疫组化染色过程中经常遇到的问题。组织中的内源性过氧化酶活性及色素常会干扰免疫过氧化酶染色；而胶体金非特异性吸附组织是构成IGSS背景染色的主要原因。胶体铁与抗体结合呈电中性后，很少再与组织发生吸附，并且其染色不受内源酶活性的干扰。普鲁士蓝反应只显示标记的三价铁，不能显示组织中内源性二价铁（除外含铁血黄素，但可通过连续切片H·E染色对照排除），因而背景干净。另外免疫斑点试验和组织染色结果表明，免疫胶体铁间接法敏感性与IGSS基本相同但高于ABC染色，从上述两方面看，该方法要优于免疫酶及免疫金银染色。
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