第六章 亲合组织化学技术及免疫细胞化学技术的某些进展

很早以前，人们就注意到给动物饲以大量的鸡蛋白，会引起明显的“维生素H缺乏症”，也称为“蛋白质伤害”。经研究发现，在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白，分子量为68000，属于糖蛋白，当时命名为卵白素（Avidin），卵白素具有4个同维生素H（Riotin,又名生物素）亲合力极高的结合点。给动物饲以大量鸡蛋白所致的维生素H缺乏，就是由于卵白素和大量的维生素H结合所致。维生素H（以下统称生物素）是一种小分子的维生素，分子量为244，系转氨甲酰基化过程中的辅酶，它与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时，生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。免疫细胞化学工作者利用上述特性，建立了卵白素—生物素免疫染色系统。由于维生素H习惯上称为生物素，为便于理解，现在译名上统称卵白素为抗生物素或亲合素。所以卵白素—生物素免疫染色系统又称为抗生物素—生物素免疫染色法。

（1）基本原理：ABC法是Hsu 等于1981年在HRAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。与LAB法和BRAB法不同的是第一抗体不为标记物所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接。复合物是将过氧化酶结合在生物素上、再将生物素—过氧化酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的（图6-1），最后进行显色反应定位。
shiyongmianyixibaoyuhesuan036.jpgABC法
图6-1　ABC法
（2）操作步骤
①冰冻切片或石蜡切片均可。
②冰冻切片可用丙酮固定10min左右，0.01mol/l PBS (pH 7.2～7.6) 洗5min，更换3次。石蜡切片需经脱蜡，系列酒精至水。
③第一抗体，室温孵育15min。
④PBS洗5min，更换3次。
⑤加生物素标记的第二抗体（1：200左右），孵育15min。
⑥PBS洗5min，更换3次。
⑦加ABC复合物室温作用15min 。
⑧PBS洗5min，更换3次。
⑨用DAB—H2O2液（配法见附录）显色。
⑩复染。
⑾封片、观察。
ABC复合物的配制：经试验，生物素与抗生物素之比为1：4时，能获得最佳满意效果。即抗生物素10μg/ml加2.5μg/ml生物素，应用0.05mol/l Tris—HCl液，pH7.6，在应用前30min配制。
（3）ABC法的评价及实验注意事项
ABC法具有：①敏感性强：Hsu等应用ABC法与PAP法相比发现敏感性较PAP法高20～40倍能显示PAP法所不能显示的抗原。这是因为生物素与抗生物素间有较强的结合力，一个抗生物素分子具有可与生物素结合的4个活性部位，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶相结合，另一部分可与生物素标记的免疫球蛋白结合。生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶分子相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白分子可以结合多个生物素分子，从而增加了免疫球蛋白或过氧化物酶结合抗生物素的能力。在ABC反应中，抗生物素作为桥连接于生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为桥连接于抗生物素分子之间，于是形成了一个含有3个以上过氧化物酶分子（大于PAP复合物）的网格状复合物，敏感性极大提高。②特异性强，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗体和第二抗体都可被稀释至尽可能的高度，减少了非特异性染色。③方法简便，节　约时间：由于ABC法敏感，操作的抗原抗体反应的时间可由PAP法所需的数天缩短为2h左右，各层抗体作用仅需15min。④国内上海生物制品所等单位制备的生物素—抗生物素染色药盒经质量鉴定符合标准，已提供国内市场。⑤由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。
实验注意事项：
①内源性生物素活性及其消除：生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节　中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，在应用ABC方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min左右，以消除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBS洗5min，更换3次。Nar－itoku和Taylor（1982）报告神经组织中的乳糖可与抗生物素结合产生假阳性反应，以2—甲基-O-甘露糖预孵育切片可封闭神经组织内乳糖分子上的结合点，从而阻止与抗生物素蛋白的结合。必要时，也可用0.3%H2O2—100%甲醇孵育以消除内源性过氧化 物酶活性。
②生物素制剂之间相互亲合性差异大，因此在应用ABC试剂时，应注意厂家和批号，对购进试剂应进行事先测试，以保证实验结果的稳定性。
③ABC试剂保存温度以4℃为佳，据报告保存可达两年之久，仍能获得满意效果，而在—20℃生物活性在短期内即被破坏。

该技术方法是用生物素分别标记抗体和酶，然后以抗生物素为桥，把两者连接起来（图6-2）。
shiyongmianyixibaoyuhesuan037.jpg RAB技术
图6-2B　RAB技术
检查抗原时，先用生物素标记的抗体与细胞（或组织内）的抗原反应，洗去未结合的抗体，加入抗生物素孵育后，洗去未结合的抗生物素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以细胞化学方法呈色反应。

以生物素标记抗体作第一抗体，酶标记抗生物素作为第二抗体（图6-3）。操作步骤如下：
shiyongmianyixibaoyuhesuan038.jpgLAB技术
图6-3　LAB技术
（1）切片在含有25～50μg/ml生物素标记抗体（PBS液稀释）中孵育1h，室温。
（2）PBS洗2次，每次5min。
（3）用20～50μg/ml过氧化物酶标记的抗生物素液孵育90min，水洗。
（4）酶呈色反应。
BRAB法和LAB示是Guesdon及其同事们（1979）建立的，由于这二种方法都需以生物素标记第一抗体，应用不如ABC法普遍。但用于免疫细胞中免疫球蛋白的显示具有特异性。二者比较，LAB法手续较简便，但灵敏度较低。
生物素—抗生物素染色法采用免疫细胞化学染色中各种常用固定剂（见附录），均可获得较满意的结果。但有实验报告推荐“PLP”固定液（即过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛固定液），其配制法亦见附录。PLP固定后，依次经系列蔗糖磷酸缓冲液（10%，15%，20%各5min），进行冰冻切片，贴于载片上，置室温风干30min或37℃3～4h或过夜。染色前用PBS湿润水化切片，可获得满意染色效果。

葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A, SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀。Jensen（1959）也发现类似现象，并将其命名为A抗原。直到1963年Lofkvist等分离了该抗原，并证明它是一种蛋白质。为与A与糖相区别，Grov（1960）将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA或蛋白A（Protein A）。由于SPA的一些免疫特性，它已引起广大免疫学者的兴趣，并发展成为免疫学上一种极为有用的工具。

（1）SPA存在于大多数（90%）金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异，以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株（Methicillin—resistant strain）能产生分泌性SPA，它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似，但易分离，损失少。
（2）SPA为蛋白质成分，仅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热油提法，所测分子量为12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol/L鸟嘌呤盐酸盐中凝胶过滤，测出分子量为42000。SPA为多肽单链，内含3个高度相似的Fc段结合区，每区由50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定。SPA粘度高于球蛋白，等电点为pH5.1，其天然结构十分稳定，在应用6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构。
（3）SPA之所以引起免疫学家的重视，是因为它具有的免疫学特性。SPA具有和人与许多动物如豚鼠、猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段，这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的，每个SPA分子可以同时结合两个IgG分子，也可一方面同IgG相结合，一方面与标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是，和SPA结合后的IgG可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐等使之解离。SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性，如SPA与人IgG亚型：IgG1、IgG2、和IgG4有结合力，唯独不结合IgG3。只结合IgA2，而不结合IgA1。SPA和禽类血清IgG不结合。
（4）SPA具有多种生物学作用，如引起豚鼠解离体回肠和收缩，在吞噬反应中抑制IgG调理素吞噬和杀菌作用，SPA—Igg 复合物能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体，对人类B细胞具有促有丝分裂因子的作用等。

自70年代开始，国外应用SPA建立了许多敏感、特异性强、快速和简易的实验方法，并在许多方面的应用中积累了实际应用的材料，现已广泛应用到免疫学及其相关科学如细胞学、细菌学和病毒学等。其可能应用的范围可归纳为以下四个方面：
1．应用于免疫球蛋白的制备和分析　SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂。由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的PSA—IgG可再用解离剂如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸盐或6mol/L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离，多用SPA—Sepharose 层析柱分离IgG或其亚型及断片如Fc、Fab等。
2．应用于免疫细胞化学 　由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受种属限制这一特点外，SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体，应用间接染色，时间较PAP法省时一半。SPA分子量小（13000～42000），易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。
3．应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集剂，用于某些细菌和病毒的定群和分型（详见第二章　第三节　）。
4．可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂　Hallgsen用同位素标记SPA测定血IgG的凝集物，发现85%全身性红斑狼疮和42%类风湿病人血清中凝集物增高。SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。Ghetie（1976）用SPA致敏绵羊红血球，与经IgG处理的细胞形成玫瑰花环，来鉴定带Fc受体的细胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花环形成，则可定量测定细胞表面的IgG。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合，可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。特别是蛋白A—胶体金技术（Protein A—Gold technique, PGA技术）自Pomano和Romano（1977）首次报告用于标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以后，已得到愈来愈广泛的应用（详见第七章　），是一种较为理想的免疫电镜技术。

SPA可为多种示踪物如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白等所标记，应用较广的为酶标记SPA和金标记SPA技术，后者将在第七章　中叙述。标记SPA常用的酶为HRP。可应用于间接法。SPA在PAP法中可代替桥抗体。
1．SPA—HRP用于间接法的操作步骤
（1）切片经脱蜡后用0.5%H2O2—纯甲醇液处理5min以抑制内源性过氧化物酶活性。
（2）用Tris盐酸缓冲液（0.05mol/l pH7.6）洗2次，每次3min。
（3）以第一抗体血清覆盖处理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
（4）用Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。
（5）加SPA—HRP（1：100～1：400）处理30min。
（6）Tris-HCl缓冲液洗3次，每次5min。
（7）DAB—H2O2显色。
（8）复染、脱水、透明、封固。反应物为棕色。
2．SPA用于PAP法的操作步骤
（1）切片脱蜡至水洗。
（2）80%甲醇（含0.6%H2O2）封闭内源酶活性5min。
（3）10%卵白蛋白Tris缓冲液，20min。
（4）第一抗体作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
（5）0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl缓冲盐液洗片5min。
（6）SPA（1μg/ml）5min。
（7）Tris-HCl盐液洗5min。
（8）PAP复合物（无种属限制），5min。
（9）Tris-HCl盐液洗切片5min。
（10）DAB（0.6mg/ml），加0.01%H2O2反应5min，然后水洗。
（11）复染：常用Mayer’s苏木精液数秒至1min（视需要而定），水洗。
（12）脱水、透明、封固、镜检。
3．SPA—HRP的制备 　应用Nakane和Kawaoi1974年建立的过碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg,SPA5mg。
（1）10mg 溶于新鲜配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氢钠溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯无水乙醇溶液以封闭酶分子中的氨基，使不发生酶的自身聚合，室温轻轻搅拌1h。
（2）加入1ml0.04～0.08mol/L（依不同批号的酶而定）的NaIO4，室温搅拌30min。
（3）加入1ml0.16mol/L乙二醇，室温轻搅1h。
（4）对1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸盐缓冲液充分透析（4℃，过夜），换缓冲液3次。
（5）加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸钠缓冲液1ml，室温轻搅2～3h。
（6）加5mg硼氢化钠（NaBH4）终止氧化，置4℃冰箱3h或过夜。
（7）对PBS透析24h，4℃离心去沉淀，半饱和硫酸铵洗沉淀结合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
（8）对PBS充分透析，经测定后分装，贮于-20℃冰箱中保存备用。
用过碘酸钠法可以得到很高标记率的HRP-SPA标记物，而且保存了抗体的全部活性，敏感度高，稳定性强，大大优于戊二醛标记抗体法，国内现在也有HRP-SPA的标记物供应，但要注意由于各家所用的SPA可能来源于不同菌株，在性质上可能存在一些差异。
【注意事项】
①在使用二硝基氟苯后，会产生氟化氢，应充分透析除净，否则抑制酶活性。
②标记时过碘酸浓度不宜过高，氧化时间不宜过长，否则会产生过度标记，即多个酶分子结合到一个蛋白A分子上。这些过度标记蛋白A的免疫反应性很差，容易产生非特异性染色。
③标记时加入酶与SPA的比例应适合，比值过大易产生过度标记，比值小则标记蛋白A产率低。
④过碘酸氧化结果能使酶具有多个醛基，从而能与多个蛋白分子的氨基相结合，成为一些大分子的聚合物。因此，有作者强调指出，对要求具有较强的细胞穿透力的免疫细胞化学实验时应予以考虑是否适用。但国内有实验室应用上海生物制品所产生的应用过碘酸氧化法制备的HRP—SPA于免疫电镜研究仍获得了较为满意的结果。

凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。其常见种类见表6-1。常用的为植物 表6—1 常见的凝集素一览表

凝 集 素	缩 定	特异性结合
花生（ Peanut agglutinin）	PNA	D—半乳糖、Gal(1→3)—GalNAC
刀豆（Concanavalin ensifomis agglutinin）	ConA	D-葡萄糖、D-甘露糖
蓖麻（Ricinus communis agglutinin）	RCA	D—半乳糖、D-GalNAC>半乳糖
扁豆（Lens cuinaris agglutinin0	LCA	D-甘露糖、D—葡萄糖
豌豆（Pisum satiwum agglutinin）	PSA	D-甘露糖
菜豆（Phaseolus vulgaris agglutinin）	PHA	D-GalNAC
大豆（soybean agglutinin）	SBA	D-GalNAC>>D-半乳糖
荆豆（Ulex europeaus agglutinin）	UEA	L-岩藻糖
麦胚(Wheat germ agglutinin)	WGA	D-GalNAC、NANA
(Bandeiraea simplicifolia agglutinin)	BSA	D-半乳糖
双花扁豆（Dolichos bifows agglutinin）	DBA	D-GalNAC
槐（Sophora japonica agglutinin）	SJA	D-半乳糖、D-GalNAC

凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanutagglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它们的总称。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，它们之所以被收入本书，是由于凝集素具有的某些“亲合”特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。因此，Ponder（1983）提出应称“凝集素组织化学”而不能称为“凝集素免疫组织化学”。

凝集素具有多方面的特性，在此我们仅简要提及其与免疫细胞化学技术方法应用有关的某些特性。我们知道，生物膜中含有一定量的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特点在于它们能识别糖蛋白和糖肽中，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结构，即细胞膜表面的碳脂化合物决定簇。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力，如刀豆素与α—D—吡喃糖基甘露糖（α—D—Mannopyranosy）结合；麦芽素与N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine）结合；菜豆凝集素与N—乙酰乳糖胺结合（见本章　表6—1）。 因此，凝集素可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜与/或电镜水平显示其结合部位。

一般认为细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型和反映细胞在分化、成熟和肿瘤细胞性变中的变化。仅在某些特殊的例子，其细胞结合凝集素的性能可以预先估计，如双花扁豆素之于血型A物质的特异性，荆豆凝集素之于血型O物质2—L—岩藻糖的特异性，然而在绝大多数情况下，关于由凝集素所识别的碳水化合物决定簇的种类，关于携带决定簇的分子的性质和机能，完全凭实验经验去发现。
1．作为细胞分化和成熟的标记 　应用凝集素作为细胞分化的标志，在这方面的应用报告最多，而且研究比较集中于血细胞，特别是淋巴细胞的分群。如Rose（1980）等发现在小鼠胸腺皮质内不成熟的T淋巴细胞呈PNA阳性反应，在小鼠小肠集合淋巴小结的生发中心也发现有20%左右的PNA阳性反应细胞，后者是否属于不成熟的T淋巴细胞，是值得进一步研究的问题。Newman等（1979）以荧光素标记凝集素PNA，发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。在不成熟的大鼠乳腺上皮细胞，荧光弱或无，随着性成熟期到妊娠期乳腺上皮荧光程度逐渐加强，而泌乳期荧光强度达最高峰。在皮肤角质细胞自基底向表层分化、成熟的过程中，细胞表面的碳水化合物的分布和性质都在改变。Brabed等（1981）应用新生大鼠皮肤的实验表明，皮肤各层细胞分别与不同的凝集素相结合。麦芽素与角质化细胞相结合，蓖麻素与棘细胞和基底细胞相结合，而荆豆凝集素标记在棘细胞的表面。在成肌细胞（myeoblast）的分化与成熟过程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到类似的皮肤的改变。
2．作为细胞特殊类型的标记　Kivela和Farkkanen（1987）发现在人视网膜，PNA标记视锥细胞而不标记视杆细胞。在乳腺、乳腺上皮细胞呈PNA阳性反应而肌上皮细胞和间质细胞呈PNA阴性反应。以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于肾脏的各部，PNA和双花扁豆凝集素（DBA）主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞，荆豆凝集素（UEA）主要分布在血管内皮细胞，而麦芽素分布在肾小球。应用DBA对RIII和DDK品种的小鼠研究表明，DBA主要结合在各种组织内毛细血管内皮细胞上，电镜观察显示DBA结合在内皮细胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些组织的内皮细胞显示肯定的DBA阴性反应，说明同一种属动物的血管内皮细胞也存在有组织特异性的差别。Streit和Kreutzberg（1987）发现GriffoniaSimplicifolia凝集素特异性标记面神经节　内的小胶质细胞，其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞（astrocyte）等都显示阴性反应。在切断面神经后，增殖的小胶质细胞对Griffonia Simplicifolia凝集素的反应加强，免疫电镜观察表明，凝集素主要沉积在细胞膜或小胶质细胞突起的轴膜表面，特异性结合糖基是α—D—半乳糖。上海医科大学附属肿瘤医院免疫病理室应用12种凝集素（表6-1）对人胚胎及各种正常组织进行了系统的凝集素受体的定位研究，结果表明，凝集素受体的分布并无即定规律可寻。如胃粘膜主细胞为PNA受体，而壁细胞为BSL受体，双花扁豆受体（DBA）主要出现在大肠部份。
3．在肿瘤中凝集素结合的改变 　肿瘤细胞伴有细胞膜的改变，细胞膜上的糖基也会产生相应的变化，可用凝集素检测出来。大量研究发现，凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。如张华忠等（1987）报道115例胃癌标记PHA阳性率高达90.43%，而正常胃粘膜基本是阴性，故认为PHA是胃癌的诊断性标志。BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79%，而对良性病变均呈阴性反应，提示BSA可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。凝集素还有助于判别肿瘤的组织类型，如神经系统星形细胞瘤ConA阳性，小胶质细胞瘤阴性，肾腺癌UEA1阴性，透明细胞癌阳性。

凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法：
1．直接法　 标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。
（1）切片脱蜡至水。
（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。
（3）TBS洗3次，每次2min。
（4）如为荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物，则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。
直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。
2．间接法 　将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上。
（1）脱蜡至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
（3）凝集素稀释液（100μg/ml）孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次2min。
（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次2min。
（7）呈色、脱水、透明、封片。
（8）观察。
间接法染色还可进一步改良为：①三步法：即在凝集素孵育后，接着用抗凝集素抗体孵育，再用标记了的抗-抗凝集素抗体孵育，层层放大，进一步提高其敏感性，PAP复合物也可作为标记物标记在抗-抗凝集素抗体上。②抗生物素—生物素凝集素法：用结合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必须购买或自制抗凝集素抗体。
3．糖—凝集素—糖法　本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖—凝集素—糖的结合物。
（1）脱蜡至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次3min。
（5）用100μg/mlHRP标记的糖液孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次3min。
（7）DAB呈色、脱水、透明、封固。
本法特异性强，灵敏度高，因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素，又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP本身含有甘露糖，能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素，本法目前普及还有一定困难，因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上，就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶，称为糖基化（glycosylation），方法虽不复杂（Lee 等1976），但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。
【注意事项】
①凝集素需要重金属离子维持其活跃的结合部位，如果金属离子耗尽了，就会影响凝集素的结合能力。因此，有作者主张用TBS作为缓冲液，内加微量的金属，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g,H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L。或在进入凝集素孵育前，先用该液孵育，以增强凝集素结合力。
②和其它抗体血清应用一样， 应用每批新的凝集素实验时，都先要用缓冲液稀释成不同等级；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，经染色选择最佳稀释度。
③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的H2O2对碳水化合物有影响，可能改变凝集素的结合形式，因此，应尽量少用或不用，我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。
④有作者认为凡经固定的组织切片，不论是石蜡包埋切片或冰冻切片，都有可能使组织中抗原隐蔽，为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团，主张在凝集素孵育前用酶处理切片，常用胰蛋白酶液（配制见附表）进行适当的孵育。
⑤已知哺乳动物的质膜含有占蛋白总量的1%～10%的碳水化合物，它们以低聚糖（oligosacchride）糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖残基，通常有两种或更多的单糖，在单糖单位末端常常是一个带负电荷的N-乙酰神经氨酸的残基，一个唾液酸（siallic acid）。有作者在凝集素实验中常用神经氨酸酶(neuramidinase)分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸，以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172）用醋酸缓冲液（含2%牛血清白蛋白）BSA配成0.5μg/ml。
切片脱蜡后进行酶消化的过程中，将该组织切片置于上述配制液中，在湿盒内，37℃孵育30min。用缓冲液洗后，进行凝集素染色。
⑥对照试验，和其它组化染色一样，凝集素染色也需要设对照试验（最好在相邻切片进行）。由于凝集素具有单糖特异性，如果外加相应的糖，把凝集素的结合部位占有了，凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖（0.2mol/L）在室温孵育30min，使之占有凝集素结合部位，再将此液代替凝集素进行孵育，结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时，只有用与凝集素有高亲合力的低聚糖（oligosachrides）代替或将切片预先用相应的糖苷酶孵育去除特异性糖基（Watanalte等，1981）。

1．HRP标记凝集素法 适用于小量的凝集素标记（Ponder 1983）。
（1）HRP的活化
①将10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸钠溶液中（1.25g/50ml）。
②加50μl含1%氟二硝基苯的无水乙醇溶液，室温轻度搅拌1h。
③加1ml含0.06mol/L的过碘酸钠的蒸馏水（0.62g/50ml），室温下轻度搅拌30min。
④在室温下加两滴0.16mol/L乙二醇，轻搅1h。
⑤用Sephadex G—25装成小柱，用0.3mol/L的重碳酸钠溶液，使含HRP的混合液过柱。
（2）结合
①正常条件下，可用凝集素及过氧化物酶各半量，但其比例可根据需要调整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸盐缓冲液里，加到“活化”的HRP中去 ，这样得出的凝集素浓度大约是0.3mg/ml，可加进0.1mol/L相应的特异的糖，以保护凝集素结合时的结合部位。糖在下步透析或层析时去掉。
②在室温下轻搅拌，结合3h。
③加入1mg硼氢化钠，室温下作用1h以稳定结合物活性。
④用1N HCl调整pH至6.4，留置室温下过夜。
（3）纯化
①用适当的凝胶层析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300层析法将游离的凝集素、游离的过氧化物酶和高分子量的成分从结合物分离出去，包括抑制性的糖也在此时分离出去。
②提纯后的结合物在280nm和403nm波长处测量其吸光率。用1%BSA先通过0.22μm的微孔过滤器，以确定被结合的凝集素是否被吸附在滤器中，然后上述结合物经过该微孔滤过器过滤到一个无菌瓶中。
③加入叠氮钠，浓度1：1000，保存于4℃C备用。
2．抗凝集素抗体的制备 　抗凝集素抗体的制备法与一般免疫血清制备大致相同（见第二章　）。所不同的是：①凝集素具有较强的毒性，易使被免疫动物发病或甚至死亡。解决的方法是经处理使凝集素变性，从而减低其毒性，但同时要保证其抗原性不受或少受破坏。②要设法阻断凝集素的糖结合部位，以减少对这些部位的抗体的产生，解决的办法是预先以相应的糖阻断这些结合部位。Leathem 和Atkin（1982）设计了一个办法，他们首先应用琼脂糖（Sepharose）珠，珠上有一系列共价糖的附着，这些糖可阻断凝集素结合部位，这种糖珠有商品供应（Sigma LtD），每1ml糖珠能结合大约12mg凝集素。其次用加入福尔马林和加热的方法使凝集素变性，毒性减低而不影响抗原性。具体操作如下：
①1ml琼脂糖—半乳糖珠与1mg花生凝集素相结合，室温1h。
②加入10ml 10%福尔马林，在水浴中加热到60℃，1h。
③用盐水离心洗珠，将珠分成以10μl为单位的若干小份，保存在-20℃。
④皮下多处注射两只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃备用。

免疫细胞化学技术在继续改进和完善中，新的技术方法不断出现。除目前国内已开始应用的免疫金技术和免疫金银技术外，80年代，新的免疫细胞化学技术还有半抗原交联抗体法和令人瞩目的分子杂交免疫细胞化学技术。免疫金银技术和分子杂交免疫细胞化学技术将分别以专章　叙述，本节　仅就半抗原交联抗体法作一简要介绍。
【半抗原交联抗体法（Hapten –Coupled techniques）】
近年来，为提高敏感性和减低非特异性染色，有些学者（Cammisuli 1976; Jassani 1981;Falini 1983）在常规免疫细胞化学技术的基础上，发展了半抗原交联抗体法，可作免疫荧光或免疫酶染色。本法的基本原理是应用半抗原标记第一抗体。常用的半抗原有阿散酸，即对氨基苯砷酸（Arsanilic acid, ARS）,对氨基苯酰甘氨酸（P—aminobenzoyl glycine），亚对氨苯酰甘氨酸（N—P—aminobonozyl glutamic acid）和二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂（dinitrophenyl aminopropionitrileimido ester, DNP）。通过酰胺化反应把半抗原结合到抗体分子上。在间接法（二步法）中，先以半抗原标记的特异性抗体（第一抗体）孵育切片，然后加入半抗原的标记抗体，（标记物可为荧光素或酶）（图6-4）。在PAP染色（三步法）中，先用半抗原标记的第一抗体孵育切片，再加未标记的抗半抗原特异性抗体作为桥抗体，第三步加半抗原交联的PAP与之反应，并作酶的呈色反应（图6-5）。第一和第三抗体分别为半抗原标记的特异性抗体和以半抗原标记的抗酶抗体制备的含半抗原的PAP复合物。本法具有许多优点，主要是：①敏感性高。由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原，对抗体活性损失极小，抗体保留较高的活性，能结合较大量的半抗原，平均每个球蛋白分子可同时结合20个半抗原分子，每个半抗原又可用抗半抗原抗体相结合，特异免疫反应明显放大，其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术，特别有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织。②可用于双重免疫染色。利用两种交叉反应的半抗原如阿散酸和对氨基苯酰甘氨酸分别标记来自同一种动物的两种特异性（第一抗体）血清，应用两步法或三步法，即可在同一张切片内同时显示两种不同的抗原。③由于特异性强、敏感性高，因此背景染色低。
shiyongmianyixibaoyuhesuan039.jpg半抗原标记抗体酶技术—两步法
图6-4　半抗原标记抗体酶技术—两步法
shiyongmianyixibaoyuhesuan039.jpg半抗原标记抗体酶技术—PAP法
图6-5　半抗原标记抗体酶技术—PAP法

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