第十四章 溶血反应和补体结合试验

免疫溶血反应是补体参与的抗体致敏红细胞的溶解反应。参与反应的成分有3种：①红细胞，一般用绵羊红细胞（SRBC）；②抗红细胞抗体，也称溶血素，多为家兔抗SRBC的抗血清；③补体。
溶血反应的直接用途是测定总补体活性或溶血素的效价；也可利用溶血系统作为指示剂，检测另一反应系统的抗原或抗体，即补体结合试验。

（一）补体 检测血清补体水平或补体活性时需要从受检者采血及分离血清。做补体结合试验时多采用豚鼠血清作为实验用补体的来源。因为补体在体外极易衰变，所以检测补体活性的血清标本和作为补体试剂的血清必须新鲜。 受检者一般做静脉采血，在动物可做心脏采血。血清分离后应及时使用，最好在当日用完。必须保存时采用小量分装的办法，置－70℃下可保存数月，避免反复冻融。冻干制品可长期保存，但其活性都不同程度地比新鲜血清降低。 以豚鼠血清作补体来源时，应考虑到个体差异。为了确保血清中补体的有效活性，必须取3只以上豚鼠的血清混合后使用。 （二）绵羊红细胞 从绵羊颈静脉无菌采血，抽出血液后立即小心地注入放有玻璃珠的无菌干燥三角烧瓶中，充分旋摇15～20min，以除去纤维蛋白。也可将羊血与等量或2倍量的Alsever血液保存液混合，既有抗凝作用，又适于储存；分装后置4℃，可使用3周。 实验前，取适量抗凝血，加入8～10倍的生理盐水，轻轻混匀后2000r/min离心5min；弃上清，沉淀的红细胞用生理盐水再洗一次，这时上清为无色澄清，如显红色说明有溶血现象，应更换新鲜羊血；第三次用缓冲液洗涤，弃上清，取压积红细胞用缓冲液配制SRBC悬液，使用浓度一般为2％～5％。为使红细胞浓度标准化，可吸取少量红细胞悬液，中入20～30倍的稀释液中，在542nm波长比浊，以吸光度为标准调整红细胞浓度。 （三）溶血素 溶血素即抗绵羊红细胞抗体，多是以绵羊红细胞免疫家兔而得到兔抗血清。一般没有必要进一步提纯抗体，但在试验前需先进行加热56℃30min或60℃3min以灭活补体。 由于补体溶血试验及补体结合试验均是比较精密的试验，其结果与溶血素的效价有关，所以试验需要滴定溶血素效价；在制备抗血清的过程中，于动物采血前和分离抗血清后也需要滴定溶血素效价。 1．溶血素稀释稀释溶血素时，要先对效价有个大概的估计，以便确定稀释度的范围。动物采血前滴定时稀释范围要稍大些，实验前的滴定便以原先的记录作为参考（溶血素的效价多在数千单位以上）。溶血素稀释一般不采用连续倍比稀释法，因为稀释到最后时跨度太大，不容易确定单位。为了便于操作，现举例按表14-1配制不同稀释度的溶血素。 表14-1不同浓度溶血素的配制

最终稀释度	缓冲液（ml）	所加溶血素
稀释度		体积（ml）
1:1000	1.8	1:100	0.2
1:2000	0.2	1:1000	0.2
1:3000	0.4	1:1000	0.2
1:4000	0.2	1:2000	0.2
1:5000	0.8	1:1000	0.2
1:6000	0.2	1:3000	0.2
1:8000	0.2	1:4000	0.2
1:10000	0.2	1:5000	0.2

2．效价滴定将稀释好的溶血素及其他试剂按表14-2所示逐步加入到各试管中，放置37℃水浴，不要盖上水浴箱的盖子，以免盖子上冷凝的水蒸气滴入试管内引起非补体性溶血。30min后取出观察结果。 表14-2溶血素的滴定

管号	溶血素稀释度	试管内加的各种试剂材料				结果
溶血素(ml)		1:60稀释补体(ml)	缓冲液(ml)	20％羊红细胞(ml)
1	1:1000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
2	1:2000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
3	1:3000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
4	1:4000	0.1	0.2	0.2	0.1	全溶
5	1:5000	0.1	0.2	0.2	0.1	大部分
6	1:6000	0.1	0.2	0.2	0.1	微溶
7	1:8000	0.1	0.2	0.2	0.1	不溶
8	1:10000	0.1	0.2	0.2	0.1	不溶
9	(对照)	－	－	0.5	0.1	不溶

温育反应后，完全溶血的试管内液体红色透明，放置一段时间后管底无细胞沉淀，离心后可见少许细胞碎渣。不溶血的管内液体浑浊；放置后可见红细胞沉淀，上清无色透明。不同程度的不完全溶血介于两者的中间变化态。 按照以上标准，以产生完全溶血的最高稀释管为最大有效反应管，以该管的溶血素稀释倍数为溶血素产效价。例如表14-2中的溶血素效价应为1:4000；在1:4000稀释的情况下，反应液中所含溶血素的的量为1U/ml。 做补体活性测定或补体结合试验时，一般使用2U/ml溶血素（在本例做1:2000稀释），与SRBC悬液等体积混合。 （四）稀释缓冲液 磷酸缓冲液或巴比妥缓冲液等均可用于溶血试验，pH值应调至7.2～7.4之间。另加入适量氯化钠以保持等渗，并适当地加入一些钙离子和镁离子，这是补体活化所不可缺少的。有的配方还加入0.1％的明胶以使蛋白溶液稳定；加入0.01％NaN3可以防腐，利于较长时间保存。

（一）CH50试验原理 补体最主要的活性是溶细胞作用，这种活性很容易通过溶血反应进行检测。在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一个特殊的S形曲线（图14-1）。 mianyixuehemianyixuejianyan070.jpg溶血程度与补体含量的关系 图14-1溶血程度与补体含量的关系 从图14-1可以看出，在轻微溶血和接近完全溶血时，补体量的变化不能使溶血程度有显着改变，速溶血对补体量的变化不敏感。但在半溶血（50％溶血）上下时曲线最陡，即使补体含量仅有较小变动时，溶血程度也会发生较大的改变，也就是说对补体量的变化非常敏感。故采用50％溶血作为终点指标要比100％溶血敏感得多，这一方法称为补体50％溶血（complementhemolysis50％），简称为CH50。 （二）CH50试验方法 取新鲜血清标本进行试验。按表14-3的要求在各管中加入试剂和反应物，一起放37℃水浴箱中温育30min。 做CH50试验时，应同时配制50％溶血的标准管。取2％SRBC悬液0.5ml，加2.0蒸馏水，使SRBC全部溶解；再加入2.0ml1.8％NaC1溶液校正为等渗溶液；最后加入2％SRBC悬液0.5ml，即成为50％溶血状态；混匀后取该悬液2.5ml，随试管一起进行温育，便是50％溶血标准管。 表14-3总补体溶血活性测定

试管号码	1:20稀释血清（ml）	巴比妥缓冲液（ml）	2U溶血素（ml）	2％羊红细胞（ml）
1	0.10	1.40	0.5	0.5
2	0.15	1.35	0.5	0.5
3	0.20	1.30	0.5	0.5
4	0.25	1.25	0.5	0.5
5	0.30	1.20	0.5	0.5
6	0.35	1.15	0.5	0.5
7	0.40	1.10	0.5	0.5
8	0.45	1.05	0.5	0.5
9	0.50	1.00	0.5	0.5
10	0.00	1.50	0.5	0.5

温育后将所有试管2500r/min离心5min，通过观察比较，选择溶血程度与标准管相近的两管在分光光度计上分别读取吸光度，以最接近标准管的那一管定为最高有效反应管，取其稀释倍数代入下列公式，求得CH50的测定值（单位U）。 每毫升血清总补体活性（单位）＝×稀释倍数 用CH50法测定总补体溶血活性时，所测得的值与反应体积成反比例关系，上例采用的液体总量为2.5ml，测得的总补体活性的参考范围为50～100U/ml。 （三）临床意义 CH50法主要检测的是补体经典途径的溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平。如果测定值过低或者完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测C4、C2、C3和C5等成分的血清含量；严重肝病时血浆蛋白合成能力受损，营养不良时蛋白合成原料不足，这些也都可以不同程度地引起血清补体水平下降。 在患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病时，血清补体水平随病情发生变化。疾病活动期补体活化过度，血清补体水平下降；病情稳定后补体水平又反应性增高。另外，补体各成分在不同的自身免疫病时可有特征性的表现（详见第二十五章），因此补体检测常可作为自身免疫病诊断或是否有疾病活动的参考指标。 细菌感染、特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化过度引起血清补体水平降低。心肌梗塞、甲状腺炎、大叶性肺炎、糖尿病、妊娠等情况下血清补体水平常升高。

补体结合试验（complementfixationtest，CFT）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年Wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及HLA的检测和分析中也有应用。

该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即SRBC与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。
如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
mianyixuehemianyixuejianyan071.jpg补体结合试验示意图
mianyixuehemianyixuejianyan072.jpg补体结合试验示意图
mianyixuehemianyixuejianyan073.jpg补体结合试验示意图
图14-2补体结合试验示意图

补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 （一）试剂 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。 2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。滴定方法举例如表14-4。在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。在表14-4中可见1:64抗原和1:32抗体各作为1个单位。在正式试验中，抗原一般采用2～4个单位（1:64～1:32），抗体采用4个单位（1:8）。 表14-4抗原和抗体的方阵滴定

抗原	抗血清稀释倍数								抗原对照
1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512
1:4	4	4	4	4	4	4	3	2	0
1:8	4	4	4	4	4	3	2	1	0
1:16	4	4	4	4	3	2	2	±	0
1:32	4	4	4	4	3	1	±	0	0
1:64	4	4	4	④	2	±	0	0	0
1:128	4	2	1	0	0	0	0	0	0
1:256	3	1	0	0	0	0	0	0	0
1:512	0	0	0	0	0	0	0	0	0
抗体对照	0	0	0	0	0	0	0	0

注：1、2、3、4分别表示溶血反应强度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0为不溶血。 3．补体滴定按表14-5逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。如形14-5中的结果为1:60的补体0.12ml可产生完全溶血，按比例公式0.12×2:60＝0.2:X计算，X＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:50稀释的补体0.2ml。 表14-5补体的滴定

管号	1:60补体（ml）	缓冲液（ml）	稀释抗原（ml）		致敏SRBC （ml）		结果
1	0.04	0.26	0.1	放 置 37℃水 浴30min	0.2	放 置 37℃水 浴30min	不溶血
2	0.06	0.24	0.1		0.2		不溶血
3	0.08	0.22	0.1		0.2		微溶血
4	0.10	0.20	0.1		0.2		微溶血
5	0.12	0.18	0.1		0.2		全溶血
6	0.14	0.16	0.1		0.2		全溶血

（二）血清标本 采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于－20℃。血清在试验前应先加热56℃30min（或60℃3min）以破坏补体和除去一些非特异因素。血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：①加热提高12；②－20℃冻融后离心去沉淀；③以3mmol/L盐酸处理；④加入少量补体后再加热灭活；⑤以白陶土处理；⑥通入CO2；⑦以小白鼠肝粉处理；⑧用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。 （三）正式试验 以小量法测定抗体的补体结合试验为例。按表14-6逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。补体对照管应呈现2U为全溶，1U为全溶略带有少许红细胞，0.5U应不溶。如0.5U补体对照出现全溶表明补体用量过多；如2U对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。 表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序

反应物（ml）	待检血清管		阳性对照管		阴性对照管		抗原对照管	补体对照管			红细胞对照管
测定	对照	测定	对照	测定	对照	2U		1U	0.5U
稀释血清	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	－	－	－	－	－
抗原	0.1	－	0.1	－	0.1	－	0.1	0.1	0.1	0.1	－
缓冲液	－	0.1	－	0.1	－	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.4
2U补体	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	－	－	－
1U补体	－	－	－	－	－	－	－	－	0.2	－	－
0.5U补体	－	－	－	－	－	－	－	－	－	0.2	－
混匀，置37℃1h或4℃16～18h
致敏红细胞	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
混匀，置37℃30min后观察结果

补体结合试验是一种传统的免疫学技术，能够沿用至今说明它本身有一定的优点：①灵敏度高。补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05μg/ml的抗体，可与间接凝集法的灵敏度相当。②特异性强。各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。③应用面广，可用于检测多种类型的抗原或抗体。④易于普及，试验结果显而易见；试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。
补体结合试验可应用在以下几方面：①传染病诊断。病原性抗原及相应抗体的检测。②其他抗原的检测。例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、HLA分型等。③自身抗体检测。
但是补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁锁并且要求十分严格，稍有疏忽便会得出不正确的结果，所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。