第二十一章 淋巴细胞标志和功能的检测

一、特异性抗原的检测 检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如表21-1所示。 表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特异性

CD抗原	特 异 性
CD2	E受体、全部T细胞和部分NK细胞
CD3	成熟T细胞
CD4	T（辅助/诱导）细胞、Mφ、HIV受体
CD8	T（杀伤/抑制）细胞、NK细胞的亚型
CD25	活化T细胞、IL-2受体

用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。两类方法各有优缺点。以下叙述有代表性的方法。 （一）间接免疫荧光法 本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。 （二）免疫细胞化学法 通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。本法简便易行，不需特殊仪器，一般试验室均可采用。 （三）抗体致敏细胞花环法 用相应的CD单克隆抗体致敏醛化的红细胞作为指示物，它与受检的细胞混匀后，置室温片刻，继经低速离心，移放室温作短期温育或4℃过夜后，重悬取样涂片染色镜检。凡受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞，共计数100～200个细胞，以花环形成数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。本法需有相应的致敏红细胞试剂，受影响的因素较前两法多。 二、特异性受体的检测 T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体和T细胞抗原识别受体（TCR），其中E受体曾广泛被用作鉴定和计数T细胞的标志。当人T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比例混匀后，置4℃至少2h或过夜，T细胞表面的E受体能与绵羊红细胞结合而形成玫瑰花样的花环（图21-1），取样涂片染色、镜检计数可得总花环形成北，亦即T细胞的百分率。如减少淋巴细胞与绵羊红细胞的比例，两者混合后，经短时间的温育即行取样涂片镜检计数，仍可见部分淋巴细胞形成花环，称为活性E（Ea）花环，它可能代表T细胞的一个亚群，正常值仅为总E花环的1/3～1/2，约20％～40％。检测Ea花环形成细胞比总E花环形成细胞更能反映受检者的细胞免疫水平。这类花环试验多种多样，因操作简便易行，曾被广泛使用，但影响因素较多，操作稍有不同，所得结果差异较大，因此渐被检测CD抗原方法所取代。 mianyixuehemianyixuejianyan122.jpg显微镜下的E花环 图21-1 显微镜下的E花环 有些哺乳动物与人类相似，其外周血中T细胞能与某种或某几种动物的红细胞结合形成花环，其匹配如牛、猪淋巴细胞与绵羊红细胞，狗－人、猫－豚鼠、豚鼠－兔，因此这些相应的花环试验可以作为实验研究细胞免疫有用的技术之一。T细胞抗在识别受体分α/βTCR和γ/δTCR，可用相应单克隆抗体作免疫荧光检测，现仅作为研究的工具。

T细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，据此建立了一系列的检测方法，其中有些已用作临床检测细胞免疫功能的指标。

本试验又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，主要表现为短时间内细胞表面电荷即起变化，数小时后细胞内酶活化，在24～48h细胞内蛋白质和核酸合成增加，从而产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、染色质疏松、淋巴细胞转变成母细胞（图21-2）。因此，这种淋巴细胞增殖又称淋巴母细胞转化（lymphoblasttransformation）。淋巴细胞增殖反应既可通过形态学观察计数，也可用3H-TdR掺入法检测细胞内DNA合成量的增加，据此判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
mianyixuehemianyixuejianyan123.jpg淋巴细胞转化的形态特征
mianyixuehemianyixuejianyan124.jpg淋巴细胞转化的形态特征
mianyixuehemianyixuejianyan125.jpg淋巴细胞转化的形态特征
图21-2 淋巴细胞转化的形态特征
体外引起淋巴细胞转化的刺激物种类很多，可分为非抗原性刺激物和抗原性刺激物两类。
1．非抗原性刺激物如植物血凝系（phytoagglutinin，PHA）、刀豆素A（concanavalinA，ConA）、美洲商陆（pokeweedmitogen，PWM）和脂多糖（LPS）等，通称促有丝分裂原（mitogen）。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B两类细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖。
2．抗原性刺激物如破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD）和白色念珠菌等。同种异型组织抗原也可作为刺激物，例如HLA，用混合淋巴细胞培养法观察器官移植中受体细胞对供体细胞的反应性实质上也是一种淋巴细胞转化试验。
非抗原性刺激物可使正常人外周血中的淋巴细胞引起转化，与机体是否对某种抗原致敏无关，因此属非特异的淋巴细胞转化。抗原刺激物的作用只能使相应致敏的淋巴细胞发生转化，因此转化率大大低于非特异性转化。通常应用最多的刺激物是PHA，特异性抗原仅使已经相应抗原致敏的T细胞发生转化，转化率一般约5％～30％，而且需要培养4～5天。虽然T细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是相同。因此根据非特异性促有丝分裂原激活T细胞增殖反应的程度，同样可推测T细胞识别特异性抗原增殖反应。目前淋巴细胞转化试验是判断T细胞功能的一项常用的非特异性体外免疫学检测指标。
该试验有形态计数法和同位素计数法两种。
（一）形态法
其原则是将外周血液或分离的单个核细胞与适量的PHA混合，置37℃培养72h，取培养细胞作涂片染色镜检。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下列计算转化率：
转化率＝转化的淋巴细胞数／（转化的淋巴细胞数＋未转化的淋巴细胞数）×100％
在正常情况下，健康人外周血经PHA刺激的淋巴细胞转化率为60％～80％，小于50％可视为降低。形态学方法简便易行，便于基层实验室推广采用，但判读结果受主观因素影响较大，有些细胞形态难以确认，因此重复性和可靠性较差。
（二）同位素法
绝大多数外周血中T细胞通常处于细胞周期的G0期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G0期进入G1期，并合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加3H标记的DNA前体(3H胸腺嘧啶苷，3H-TdR)，后者即掺入新合成的DNA中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度。检测原则是将全血或分离的单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，每份样品分实验管和对照管，实验管加最适量和亚适量PHA后，移置5％CO2温箱37℃培养56h，加适量3H-TdR，继续培养16h，结束后将细胞收集在玻璃纤维膜上，递经处理，最后用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数(cpm)，算出3个复管的均数±S。通常以刺激指数(SI)表示转化能力。
SI＝PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值
由于对照管组和刺激组实验条件一致，故用SI表示淋巴细胞增殖能力可以减少可变因素的干扰，但对照组同位素掺入量的增加或减少，能使SI发生明显变动，以致有时不能反映真实的增殖情况，因此最好同时参照对照组和实验组的cpm加以判断。值得强调的是目前配制的PHA多为最适浓度，在该条件下，功能略逊的细胞仍有应答能力。如同时采用最适和亚适浓度，一些细胞免疫功能较低的T细胞对亚适浓度的PHA则缺乏或仅呈极弱的应答，故在一定程度上可识别出应答功能较差的T细胞群。

T细胞介导的细胞毒性（lymphocytemediatedcytotoxicity，LMC）是细胞毒性T细胞（CTL）的特性，凡致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。该试验的原则是选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株，经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，观察肿瘤细胞被杀伤情况，常用方法如下：
（一）形态学检查法
淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育后，以瑞氏染液着色，用显微镜计数残留的肿瘤细胞数，计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制率：
抑制率％＝（对照组平均残留级肿瘤细胞数－实验组平均残留细胞数／对照组平均残留肿瘤细胞数×100％
（二）同位素法
一般采用125I-UdR掺入法或51Cr释放法，以细胞毒指数或51Cr释放率表示T细胞的细胞毒活性。

B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床提供诊治相关疾病的有用信息。
一、B细胞表面抗原的检测
B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全部B细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC法加以检测。健康成年人外周血CD20阳性细胞约占淋巴细胞总数的8％～12％。
二、B细胞受体的检测
B细胞表面有膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
（一）SmIg的检测
大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、高特异性和高和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体，也可分别用各种类型的Ig，即IgM、IgG、IgA、IgE等抗血清，检测带有各种类型Ig的B细胞，在人外周血中以带有SmIgM的细胞数为最多。
B细胞经荧光标记的抗Ig抗体染色，细胞膜表面呈现的荧光着色可有不同的形式，开始均匀分布呈环状，其后集中在某些部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状，最后可被吞饮入胞浆直至荧光消失。这一现象是由于淋巴细胞膜由双层类脂组成，上嵌有蛋白分子，在体温条件下，膜呈半液体状，而镶嵌物能在其中移动。当SmIg抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg出现交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状，时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此染色后，观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。
（二）Fc受体和补体受体的检测
B细胞表面具有与IgGFc段结合的受体，极易与抗原抗体复合物中抗体Fc段牢固结合，故用相应抗体致敏的红细胞(EA)作批示物，在一定条件下，它能与带Fc受体的B细胞形成EA花环，故称EA花环试验。而细胞表面的补体受体，则能与红细胞(E)-抗红细胞抗体(A)-补体(C)复合物(EAC)中的补体相结合，从而建立EAC花环试验。但由于单核细胞、巨噬细胞、NK以及部分T细胞也带有Fc或补体受体。因此形成EA和EAC花环并非B细胞所特有，加上该类试验需制备新鲜指示物，操作麻烦，目前基本上已被其他试验所取代，甚少应用。
（三）小鼠红细胞受体的检测
部分B细胞能与小鼠红细胞形成花环，慢性B细胞白血病患者外周血淋巴形成小鼠红细胞花环率高达60％～85％，但健康人该花环率仅占总淋巴细胞的5％～10％，据此推知形成该花环的性能是某些B细胞亚群的标志，由于方法简便，临床可用作鉴定不同型淋巴细胞白血病。

一、体内试验
B细胞受抗原或促有丝分裂原刺激后，可行分裂增殖并分化成熟为抗体生成细胞，且分泌相应的Ig。B细胞功能减低或缺陷，可表现为体内Ig和血型抗体量下降或缺如，患者对外源性抗原的应答能力减弱或缺如，仅产生极低或不能产生特异性抗体，故临床定量测定受检者血清中各种Ig量和相应血型抗体，可判断B细胞功能，也是诊断体液免疫缺陷的指标。反之，如血清中一种或多种Ig或轻、重链片段异常增高，表明B细胞产生Ig的功能异常增高。此外给患者注射适量常用的抗原，如白喉类毒素、破伤风类毒素等蛋白质抗原，或肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等多糖抗原，经一定诱导期后，用适当的方法测定受检者血清中相应抗体的效价，根据抗体的水平也可判断受检者体内B细胞的功能。实验室常用如下的体外试验检测B细胞功能。
二、B细胞早期活性指标的测定
B细胞经不同抗原激发即开始分化增殖，初期表现为体积增大，可用仪器加以检测。激活的B细胞表面MHCⅡ类抗原的表达增多，可用相应的单克隆抗体通过荧光免疫或ABC法检测。
三、溶血空斑形成试验
经典的溶血斑试验用于检测实验动物抗体形成细胞的功能，其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠，4天后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或玻片上，使成一蒲层，置37温育。由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参与下导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）。每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。这种直接法所测至的细胞为IgM生成细胞，其它类型Ig由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗鼠Ig抗体(如兔抗鼠Ig)，使抗体生成细胞所产生的IgG或IgA与抗Ig抗体结合成复合物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验。
但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。如果用一定方法将SRBC用其它抗原包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的应用范围较大。
现在常用的为SPA-SRBC溶血空斑试验。SPA能与人及多数哺乳动物IgG的Fc段呈非特异性结合，利用这一特征，首先将SPA包被SRBC，然后进行溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围。在该测试系统中，加入抗人Ig抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc段可与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补体，使SRBC溶解形成空斑。此法可用于检测人类外周血中的IgG产生细胞，与抗体的特异性无关。用抗IgA、IgG或IgM抗体包被SRBC，可测定相应免疫球蛋白的产生细胞，这种试验称为反相空斑形成试验。
溶血空斑形成试验可用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响，或评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能。
四、B细胞增殖能力的试验
（一）不同刺激物诱发增殖试验
抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养1～3天以后，加3H-TdR，与淋巴细胞增殖试验一样，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝法计细胞增殖或用DNA特异性染色观察胞内DNA或RNA的分化程度。
（二）葡萄球菌诱导试验
葡萄球菌CowenⅠ株（SAC）表面富含SPA。该试验不依赖T细胞的参与，操作原则是将SAC与淋巴细胞按一定比例混合，按增殖试验法同样操作和计数cmp值。葡萄球菌表面SPA含量与激发B细胞转化能力成正比。

NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD69等多种抗原，但均非NK细胞所特有，因此现今极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞，而多检测NK细胞活性。NK细胞株作为靶细胞，而测小鼠NK细胞活性则用YAC细胞株，检测方法多种多样，各有其优缺点。
（一）形态法
检测原则是将效应细胞与靶按一定比例混合共育，继而台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理，然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，由此推算NK的细胞的杀伤活性。本法简便，易于掌握，但判断死细胞与活细胞不免带有检测者的主观因素，也无法计数轻微损伤的细胞。
（二）酶释法
检测原则是将一定比例的效应细胞和靶细胞共温一段时间后，离心沉淀，取上清液检测靶细胞遭破坏后释放的乳酸脱氢酶或碱性磷酸酶含量。本法经济、快速简便，但可定量。缺点是靶细胞内碱性磷酸酶含量低或因某些未死亡细胞能自行释放，从而影响法灵敏度和特异性。此外乳酸脱氢酶分子较大，仅当靶细胞膜完全被破坏时才释放，故不能较早地反映效应的功能。
（三）荧光法
检测原则是用荧光素标记靶细胞，经与效应细胞共温后，离心法上清，用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光，缺点是活细胞释放的荧光常被效应细胞和培养液等所粹灭。另外，荧光分析法常遇细胞自然释放率高，荧光本底强，影响灵敏度。为克服上述障碍，用时间分辨荧光免疫分析，将靶细胞用镧系元素铕（Eu3+）的螯合物标记，按同法与效应细胞共温后，用时间分辨荧光计检测荧光，可除去非特异性荧光本底。本法实验时间短，效靶细胞仅需共温2h，检测速度快，特异性强。
检测原则是将效应细胞和靶细胞按一定比例混合温育后，直接检测靶细胞。分有靶细胞浆释放法和胞核释放法。
1．胞浆释放法常用51Cr释放法。51Cr透过细胞膜与胞浆中小分子蛋白质结合，一旦细胞膜遭破坏，同位素随蛋白质外溢，并且不会被完整的细胞再度摄入。本法操作简便快速能定量，缺点是自然释放率高，所需靶细胞数量多，51Cr半衰期短。近年有用111In（铟）检测NK细胞活性，优点是标记率高，用量微，以γ射线放射，可释放90％的自身能量，比51Cr高10倍，自然释放率低，仅为51Cr的一半。
2．胞核释放法常用3H-TdR或125IudR作为DNA合成的前体物，可被摄入靶细胞核内。当效应细胞和靶细胞共温后，用胰酸和DNA酶处理可使遭破坏的胞核内容物释放。本法自然释放率比51Cr低，半衰期较长，方法的敏感性高，故被大多数实验室所采用。
（五）化学发光法
检测原则是当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸爆发，生成极不稳定的O2－和OH－等，放出光子，在发光剂存在的条件下，可被电倍增管接受和计数，发光量与NK细胞杀伤能力相关。
总之，检测NK细胞活性的方法多种多样，方法的简繁有很大差异，但敏感性和特异性亦异，从简单的活细胞计数直至最先进的流式细胞仪分析，一般可根据实验要求和具体条件选用。