第二十三章 细胞因子和细胞粘附分子的检测

检测细胞因子的方法主要有生物学检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。
一、生物学检测法
生物学检测又称生物活性检测，是根据细胞因子特定的生物活性而设计的检测法。由于各种细胞因子具有不同的活性，例如IL-2促进淋巴细胞增殖，TNF杀伤肿瘤细胞，CSF刺激造血细胞集落形成，IFN保护细胞免受病毒攻击，因此选择某一细胞因子独特的生物活性，即可对其进行检测。生物活性检测法又可分为以下几类：
1．细胞增殖法许多细胞因子具有细胞生长因子活性，特别是白细胞介素，如IL-2刺激T细胞生长、IL-3刺激肥大细胞生长、IL-6刺激浆细胞生长等。利用这一特性，现已筛选出一些对特定细胞因子起反应的细胞，并建立了只依赖于某种因子的细胞系，即依赖细胞株（简称依赖株）。这些依赖株在通常情况下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依赖株CTLL-2在不含IL-2的培养基中很快死亡，而加入IL-2后则可右体外长期培养。在一定浓度范围内，细胞增殖与IL-2量呈正比，因此通过测定细胞增殖情况（如使用3H-TdR掺入法、MTT法等）鉴定IL-2的含量。除依赖株外，还有一些短期培养的细胞，如胸腺细胞、骨髓细胞、促有丝分裂原刺激后的淋巴母细胞等，均可作为靶细胞来测定某种细胞因子活性。
2．靶细胞杀伤法是根据某些细胞因子（如TNF）能在体外杀伤靶细胞而设计的检测方法。通常靶细胞多选择体外长期传代的肿瘤细胞株，利用同位素释放法或染料染色等方法判定细胞的杀伤率。
3．细胞因子诱导的产物分析法某些细胞因子可刺激特定细胞产生生物活性物质，如IL-2、IL-3诱导骨髓细胞合成胺、IL-6诱导肝细胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通过测定所诱生的相应产物，可反映细胞因子的活性。
4．细胞病变抑制法病毒可造成靶细胞的损伤，干扰素等则可抑制病毒所导致的细胞病变，因此可利用细胞病变抑制法检测这类因子。
二、免疫学检测法
细胞因子均为蛋白或多肽，具有较强的抗原性。随着重组细胞因子的出现，可较方便地获得细胞因子的特异性抗血清或单克隆抗体，因此可利用抗原抗体特异性反应的特性，用免疫学技术定量检测细胞因子。尽管细胞因子种类繁多，只要获得了针对某一因子的特异性抗体（包括多克隆抗体或单克隆抗体）均可采用相似的技术开展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印迹法。目前，几乎所有常见细胞因子的检测试剂盒均有商品供应。此外还可利用酶标或荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体，原位检测因子在细胞内的合成及分布情况。免疫学检测法可直接测定样品中特定细胞因子的含量（用ng/ml表示），为大规模检测临床病人血清中细胞因子的含量提供了方便。本法仅测定细胞因子的抗原性，与该因子活性不一定相平行，因此要了解细胞因子的生物学效应，必须结合生物学检测法。
三、分子生物学方法
这是一类利用细胞因子的基因探针检测特定细胞因子基因表达的技术。目前所有公认的细胞因子的基因均已克隆化，故能较容易地得到某一细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。利用基因探针检测细胞因子mRNA表达的方法多种多样，常使用斑点杂交、Northernblot、逆转录PCR，细胞或组织原位杂交等。实验的关键在于制备高质量的核酸探针和获得合格的待测物（提取的mRNA样品或细胞/组织标本）。核酸探针是指一段用放射性同位素或其他标记物（如生物素、地高辛等）标记并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。根据其来源可分为cDNA探针、寡核核苷酸探针、基因组基因探针及DNA探针等。其中cDNA探针和人工合成寡核苷酸探针常用于斑点杂交及Northernblot，而RNA探针因穿透性好更适用于原位杂交。核酸探针技术的应用已经程序化，以cDNA探针为例主要包括：①质粒DNA的提取；②靶DNA片段的分离；③靶DNA片段标记；④待测样品mRNA的提取；⑤标记cDNA探针对待检样品的杂交；⑥放射自显影或显色分析。近年来出现的RT-PCR检测特异性mRNA的方法也广泛用于细胞因子研究领域。该法具有灵敏、快速等优点，甚至从1～10个细胞中就可检出其中的特异mRNA。
上述三种方法，各有优缺点，可互相弥补，在实际应用中，呆根据各自的实验目的和实验室条件进行选择。生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低生物活性检测法（约低10～100倍）。分子生物学法只能检测基因表达情况，不能直接提供有关因子的浓度及活性等资料，主要用于机制探讨。

现已发现的白细胞介素（IL）多达10余种，兹举有代表性的几种IL检测法藉以举一反三。

IL-1有两种分子形式，即IL-1α和IL-2β，它们的生物学活性基本相同，均可采用生物学检测方法进行检测，若要区分IL-1α和IL-2β需用免疫学检测法。
（一）细胞增殖法
1．淋巴细胞增殖法IL-1具有淋巴细胞活化因子的活性，可以协同促有丝分裂原刺激T细胞或胸腺细胞发生有丝分裂，同时IL-1可以刺激T细胞产生IL-2或其它T细胞生长因子，并使之表达相应的受体。因此用细胞增殖法检测IL-1可有直接增殖法和间接增殖法两种。
（1）直接增殖法：IL-1在促有丝分裂原存在的情况下，能够促使胸腺淋巴细胞和某些体外建株的T细胞克隆生长，因此测定这些细胞的增殖情况即可反映IL-1的活性。小鼠胸腺细胞测定法操作简单，比较常用，缺点是缺少特异性，因为IL-2亦可协同促有丝分裂原刺激胸腺细胞增殖。D10G4.1（一种小鼠TH细胞克隆）测定法较胸腺细胞测定法的敏感性高，且D10G4.1对IL-2不敏感，因此特异性增强，缺点是需要长期饲养细胞株，该实验以3H-TdR掺入法或MTT法检测细胞增殖情况。通常IL-1浓度越高，细胞转化能力越强，IL-1浓度低于0.05ng/ml时，细胞转化能力接近促有丝分裂原单独刺激的程度。
（2）间接增殖法：某些品系小鼠的T细胞系只有在IL-1存在的条件下才能产生IL-2，并且IL-2的产生量与IL-1的浓度成直线关系。因此可以利用IL-2依赖细胞株（如CTLL2）测定IL-2，藉以间接测定IL-1的含量。
2．成纤维细胞增殖法IL-1能刺激成纤维细胞的增殖，故可利用来源于新生儿包皮或传代的人皮肤成纤维细胞（如CRL1445）测定IL-1。国内常用小鼠成纤维细胞瘤L929细胞株。
检测原则是将生长成单层的L929细胞用胰酶消化后，配成适当浓度的细胞悬液，继将不同稀释度的待测样本与L929细胞悬液分加入96孔培养液中。一式三份，并设置阴性对照，放入37℃、5％CO2的温箱中温育72h，在第16h时加入适量3H-TdR，继续温育，结束后离心弃去培养上清，加入适量胰酶消化数分钟后，收集细胞测定cpm值或吸光度值。
（二）其他方法
1．骨和较骨组织测定法利用IL-1可诱导胶原酶释放，破坏软骨组织的特性，用分光光度计测定软骨硫酸盐释放量，即可间接椎知IL-1量。又如IL-1能影响骨质吸收，应用放射性45Ca通过小鼠头顶骨系统吸收可测定IL-1活性，为骨质吸收释放法。
2．PGE2测定法IL-1作用于下丘脑，诱导脑细胞合成前列腺素E2（PGE2），发挥致热原作用；还能诱导原代培养或建株传代的成纤维细胞产生PGE2，故可用放免疫技术测定PGE2藉以间接测定IL-1。
3．放射免疫测定法本法利用受检IL-1样品与碘标记IL-1竞争性结合Sepharose4B中抗IL-1抗体结合位点的原理而设计。该法敏感性较高，且可排除样品中其它干扰因素的影响，其特点是可以区分IL-1α和IL-1β。
4．体内测定法IL-1在体内可诱导发热、引起急性期蛋白合成及影响血中铁和锌水平。实验室多利用IL-1的致热原作用加以检测。在给动物静脉注射IL-1前后，以体温的升高幅度表示IL-1的活性，或定期测定血清中某些急性期蛋白的含量，如血清淀粉样蛋白A，血清淀粉样蛋白P等。
总之，由于IL-1的生物学活性比较广泛，其检测方法亦多种多样，但每种方法均有其缺点，往往需要结合使用。T细胞增殖法简便、易行且敏感，但样品中若混有IL-2，则可协同促有丝分裂原刺激T细胞增殖，从而干扰IL-1的测定。血清中的TNF同样可以刺激成纤维细胞的增殖，也可用成纤维细胞测定法，但特异性较差。放免法可排除其它因子的干扰，但此法仅测得IL-1的抗原性，不能完全代表其生物学活性。

IL-2的检测方法主要有两大类，一类是细胞增殖法，另一类是免疫学检测法。
（一）细胞增殖法
IL-2可刺激某些淋巴细胞增殖，根据细胞增殖情况可反映IL-2的活性，结果以U/ml表示。目前所用的IL-2反应细胞主要有CTLL、CTB6、F12、CTLL-2等小鼠IL-2依赖细胞株以及ConA活化的小鼠淋巴母细胞和小鼠胸腺细胞。这类细胞的增殖情况均可通过显微镜下直接计数、3H-TdR掺入法以及MTT法加以测定。
1．依赖性细胞株增殖法IL-2依赖细胞株在IL-2存在时才能生长，而对PHA、ConA等促有丝分裂原及IL-2以外的其它细胞因子均无反应。CTLL-2对IL-2的依赖性最强，表现为在单独培养时3H-TdR的掺入量低，而在IL-2存在时掺入值高，故为首选的靶细胞株。
2．T淋巴母细胞增殖法T细胞经植物血凝素激发转化为T淋巴母细胞，并表达丰富的IL-2受体，在体外IL-2存在时持续增殖，并与IL-2含量呈剂量依赖关系。
3．胸腺细胞增殖法IL-2可以增另ConA的促有丝分裂原作用而引起T血细胞大量增殖。将一定数量的小鼠胸腺细胞与亚刺激量的ConA和不同稀释的待检标本共育，在一定时间后检测IL-2增殖情况即能代表IL-2的活性。胸腺细胞增殖试验是目前检测IL-2活性最简便的方法。此法缺点是敏感性较差，如待测标本中存留有ConA会出现较强的非特异性反应等。
（二）免疫学检测法
根据抗原－抗体反应的原理，可利用抗IL-2的单克隆或多克隆抗体直接测定样品中的IL-2含量，结果用ng/ml表示。本法在rIL-2生产制备过程中可用以跟踪检测，在rIL-2基因克隆时亦可对阳性质粒进行初步筛选。