第五章 脂类代谢有关酶类

脂蛋白脂肪酶（liportein lipase, LPL）是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞，乳腺细胞以及巨噬细胞等实质细胞合成和分泌的一种糖蛋白，分子量为60kD，含3%～8%碳水化合物。活性LPL以同源二聚体形式存在，通过静电引力与毛细血管内皮细胞表面的多聚糖结合，肝素可以促进此结合形式的LPL释放入血，并可提高其活性。LPL生理功能是催化CM和VLDL核心的TG分解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存；LPL还参与VLDL和HDL之间的载脂蛋白和磷脂的转换，ApoC-Ⅱ为其必需的辅因子，其中的C端第61～79位氨基酸具有激活LPL的能力。

比较不同种类包括人类脂肪组织、牛乳腺、鼠巨噬细胞、猪脂肪组织和禽类的LPL一级结构，发现人类LPL氨基酸序列与哺乳类动物有87%～94%同源性，与禽类比较也有70%同源性，表明LPL在进化过程中的高度保守性。人类LPL、肝脂酶（HL）以及胰脂酶（PL）具有高度相似的氨基酸序列，推测三者可能起源于同一个基因家族，具有共同的作用机制。
目前人类LPL二级结构尚未阐明，推测LPL分子可能由两个结构区域构成：N端区的和C端区，N端区包括1～315位氨基酸，形成一个以β折叠为主的近球形结构，它是LPL重要的功能区，催化活性中心就位于此区。构成LPL催化活性中心的三个氨基酸分别为Ser132、His241和Asp156，用中性氨基酸取代活性中心附近的氨基酸，LPL活性明显下降或消失。Asn43是N端区一重要的糖基化位点，它起着维持LPL正常三维结构的作用。对正常分泌的LPL活性功能具有重要意义。此外，N端区第279～282位和292～309位氨基酸介导LPL与肝素结构。C端区呈一个折叠的柱状连接在球形的N端区，C端区的功能尚有争议，多数认为与介导酶与底物接触，形成活性的LPL同源二聚体以及间接参与酶解过程。
LPL在实质细胞的粗面内质网合成，新合成的LPL留在核周围内质网，属于无活性酶，由mRNA翻译合成的无活性LPL，称为酶前体，再糖基化后，才转化成活性LPL酶，如图5-1所示。从细胞中如何分泌；目前认为有两种机制，其一是细胞合成的LPL后直接分泌，不贮存于细胞内，即称为基本型分泌；其二是调节型分泌，某些细胞新合成LPL贮存于分泌管内，一旦细胞受到一个合适的促分泌剌激。LDL即分泌，此时分泌往往大于合成。所有细胞都具备基本型分泌，只有少部分细胞兼有两种分泌形式。Vannier提出，LPL是结合在插入细胞内分泌器并存在于细胞膜外表面的硫酸肝素糖蛋白（heparin sulphate protoglycans, HSPG），致使酶保持一种无活力的浓缩状态，然后通过一个尚未阐明的机制由肝素促使分泌，即肝素后血浆中得到活化的LPL，分布在含甘油三酯的脂蛋白中，并主要是分解CM和VLDL的甘油三酯并结合附着在这些脂蛋白残粒中，可能形成肝摄取这些颗粒的信号。
dongmaizhouyangyinghua024.jpgLPL的合成
图5-1 LPL的合成

LPL基因位于8P22，长约35kb，由10个外显子和9个内含子组成，编码475个氨基酸的蛋白质，包括27个氨基酸残基的信号肽。现已查明外显子1长273kp，编码5'端非翻译区和信号肽区。外显子2～5长度分别为161、180、112和234bp，其中外显子2所编码的Asn43糖基化位点为LPL催化活性必需的，外显子4编码脂质结合区。外显子6包含243bp。编码肝素结合区。外显子7～9长度分别为121、183和105bp。编码结构参与与ApoCⅡ结合。外显子10是LPL基因中最大的外显子，长1950bp，编码整个3'端非翻译区。LPL内含子7第序列尚未弄清，报道其中存在Alu重复序列和多态位点。Jurke等研究发现LPL内含子7中有一完整的Alu序列，长282bp，位于内含子7第1027～746位。Delin报道内含子6中也存在Alu序列。Alu序列在人类基因组中约占3%-6%，推测其功能与基因转录的调节，hnRNA的加工以及DNA复制的启动有关，并且是基因重排的热点位置。利用限制性片段长度多态性（RFLPS）技术检测出LPL基因位点存在多态性，主要分布在LPL基因内含子和侧翼序列中，其中内含子6中的PvuⅡ多态位点（图5-2）和内含子8中的HindⅢ（图5-3）多态位点与高脂血症有关，这为高脂血症的家系连锁分析提供遗传标记。LPL基因转录起始点上游730bp区域是转录因子结合部位，5'侧翼区一27位有“TATA”框，是LPL基因启动子所在部位。
dongmaizhouyangyinghua025.jpgLPLPvuⅡ-RFLP
图5-2　LPLPvuⅡ-RFLP
M：DNA marder
1:DNA-PCR产物（319bp）
2-6：分别为P+P+、P+P-、P+P-、P-P-、P--、P+P+、H+H+基因型
dongmaizhouyangyinghua026.jpgLPL HindⅢ-RFLP
图5-3 LPL HindⅢ-RFLP
M:DNA marker
1～4:分别为H-H-、H-H+、H+H+、H+H-基因型

Ⅰ型高脂血症为常染色体隐性遗传病，具有家族性。主要临床症状为阵发性腹痛，疹状皮肤黄色瘤和肝脾肿大，生化特征为含高甘油三酯的乳糜微粒在因浆中大量堆积，脂肪耐量显着异常，LPL活性下降，这种患者体内的LPL含量可能完全缺陷，用目前的检测方法测不出LPL存在，也不可能在肝素注射后使血浆LPL活性下降，推测可能是一种异常LPL翻译后修饰所致。 引起Ⅰ型高脂血症常见的LPL基因突变有三类：一是碱基置换突变。按性质又可分为错义突变和无意义突变，错义突变是指基因结构中某个碱基为另一个碱基取代，导致蛋白质分子中相应位置氨基酸改变，这类突变多集中在LPL活性中心所在的N端区，如Gly142、Ala176、Gly188、IIe194、Leu207、Arg243等，这些氨基酸被取代则LPL活性显著降低；无意义突变是指基因编码区发生突变后形成终止密码子，使翻译过程提前终止；导致合成肽链变短，Ⅰ型高脂血症发生与此类突变位点有关，若突变位点在第106位氨基酸的编码基因上，产生出来的短肽链产物不具有LPL催化功能，导致Ⅰ型高脂血症发生；突变位点在第447位氨基酸的编码基因（Ser447-Thr），其产物C端缺失2个氨基酸，不影响LPL活性：二是移码突变。是指在DNA分子中插入或缺失一个或几个核苷酸（但不是3个或3的倍数）造成这一位置以后的一列编码发生移位错误的突变，这种突变有的会生成终止密码而使翻译过程提前终止。有报道1例Ⅰ型高脂血症患者，其G916位碱基发生缺失，产生一个提前终止码，利用Northern印迹技术未检测到可测水平的LPLmRNA，推测此移码突变可能导致LPLmRNA稳定性下降；三是基因重排。表现为大片段缺失或插入，目前发现外显子6中2kb插入，外显子9中3kb缺失，均导致I型高脂血症。 近年研究发现，1例Ⅰ型高脂血症患者脂肪组织中存在正常活性的LPL，肝素后的血浆中检测不出LPL存在，分析其脂肪组织中LPL化学组成，发现这种LPL的寡糖链含有较高水平的果糖，影响了LPL细胞内外的转运，提示翻译后的修饰异常也可影响LPL活性发挥。 脂蛋白脂肪酶基因突变点如表5-1所示。 表5-1 脂蛋白脂肪酶基因突变

突变点	位　置	氨基酸异常
（1）剪接突变
GT→AT	内含子2	异常的mRNA生成
AG→AA	内含子2	异常的mRNA生成
（2）错义突变
T→C	外显子3	Trp96→Arg
A→G	外显子4	His136→Arg
G→A	外显子4	Gly142→Clu
A→G	外显子5	Asp156→Gly
G→A	外显子5	Asp156→Asn
C→G	外显子5	Ala157→Arg
G→A	外显子5	Gly176→Thr
G→A	外显子5	Gly186→Glu
T→C	外显子5	Ile194→Thr
C→G	外显子5	Asp204→Glu
C→T	外显子5	Pro207→Leu
T→A	外显子5	Cys216→Ser
G→A	外显子6	Arg242→His
T→A	外显子6	Ser244→Thr
G→A	外显子6	Asp250→Asn
T→C	外显子6	Tyr252→His
（3）无义突变
T→A	外显子3	Tyr61→Stop
C→T	外显子3	Gln165→Stop
C→（A/G）	外显子6	Tyr282→Stop
G→A	外显子6	Trp282→Stop
（4）插入
2kb插入	内含子6	无效等位基因
5kb插入	外显子3	外显子4的stop
（5）缺失
6kb的缺失	内含子2～5	无效等位基因
1bp的缺失	外显子5	外显子5的stop

Hahn最早观察到，对患高脂血病的狗进行静脉注射肝素，即引起患狗混浊的血浆变清，这是由于一种具有脂解活性的酶从组织的肝素结合位点上释放到血液中所致。据此推测，这种脂酶是结合在细胞表面作为肝素受体的蛋白多糖，肝素竞争性地结合到细胞表面的蛋白多糖分子后。脂酶被置换下来进入血液中，把引起血浆混浊的酯类物质水解，于是血浆由混浊而变清。后来通过Sepharose-肝素亲和柱层析纯化，可从人的注射肝素后的血浆中得到两种不同的脂酶，一种被0.6～0.8mol/l NaCl液洗脱，不被高离子强度溶液抑制，不需要血浆辅助因子活化，肝脏切除动物的肝素灌注血浆中则不存在，因此，将此酶称之为肝脂酶（hepatic lipase,HL），此酶与早年Hahn观察到的脂酶是一致的。另一种被1.2～1.5mol/l NaCl液洗脱的部分则具有LPL的性质。 肝脂酶 （hepatic endothelail lipase, HL或HTGL）是肝素化血浆中存在的另一种脂酶，属于与血液循环中内源性TG代谢有关的酶之一。与LPL在功能上有相似之处，然而却是两种不同性质的酶，其特点是：①HL活性不需要ApoC-Ⅱ作为激活剂；②SDS可抑制HL活性，而不受高盐及鱼精蛋白抑制；③主要作用于小颗粒脂蛋白，如VLDL残粒，HDL同时又调节胆固醇从周围组织转运到肝，使肝内的VLDL转化为LDL。经人及鼠cDNA克隆的DNA序列探明HLcDNA编码。HL是共有2个N连接多聚糖链的糖蛋白，含有499个氨基酸残基，分子量53kDa，基因位于第15号染色体上，有合成氨基酸残基信号肽和476氨基酸残基的成熟肽的密码。与分解代谢有关的丝氨酸位于145位。LPL和HL的基因同属一组基因族，在进化上较为保守。HL、LPL和胰脂酶（pancereaticlipase,PL）的性质有相似之处，也有不同点，如表5-2所示。 表5-2 LPL、HL和PL的异同点

	LPL	HL	PL
底物	CM、VLDL中的TG	CM、VLDL代谢残粒和HDL的TG和磷脂	胆汁酸乳化液中的TG
辅因子	血浆辅因子	不需要	辅脂肪酶
合成部位	脂肪组织、心肌和肌肉	肝脏	胰腺
定位	脂肪组织、心脏、肌肉血管的内皮细胞	肾脏、肾上腺和卵巢血管的内皮细胞	肠

HL是肝实质细胞中合成，在合成过程中，酶蛋白的糖化及紧随着的低聚糖化修饰过程是分泌HL必要条件。免疫电镜观察到HL位于肝窦状隙内皮细胞表面，在肝素化后，HL可释放到血浆，激素可调节HL的释放，主要是类固醇激素，如雄性激素可升高HL酶活性，而雌性激素则相反。当怀孕或泌乳时，肝素后血浆中HL活力与血浆的游离胆固醇或类固醇呈负相关，肾上腺素抑制HL酶活性，另外胰岛素和甲状腺素在控制HL活力也亦有作用。

卵磷脂胆固醇酯酰转移酶（lecihin:cholesterolacyl transferase,LCAT）由肝脏合成释放入血液中，是一种在血浆中起催化作用的酶，其作用是将HDL的卵磷脂的C2位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇脂。血浆胆固醇中几乎70%～80%是胆固醇酯，均是LCAT催化生成所致。LACT常与HDL结合在一起，在HDL颗粒表面活性很高并起催化作用，对VLDL和LDL的颗粒几乎不起作用。在人工基质中添加ApoA-Ⅰ，促使LCAT的活性升高。LCAT在磷脂代谢中起重要的作用。
LCAT由416个氨基酸组成。分子量为6.3kDa,属糖蛋白。糖蛋白，糖链约占24%，是维持其活性必不可少的组分。富含Glu、Gly、Pro和Leu。每一酶分子含Cys，其中两个连成二硫键。根据与胰脂酶序列的同源性比较，推测六肽：I178-G-J-S-L-G183可能是酶的活性中心。LCAT中蛋白质α螺旋、β-折叠和其他的结构分别占21%、24%和55%。LCAt mRNA约为1400bp组成，其信号肽是440个氨酸组成的密码子。
LCAT由肝脏合成并分泌至血浆，以游离或与脂蛋白结合的形式存在。LCAT选择性底物是HDL，特别是新生盘状或小球形HDL3。HDL核心是LCAT酶反应产物胆固醇的贮存库，并通过胆固醇酯转移蛋白将CE转移至其他脂蛋白和细胞膜，并与其交换。
LCAT除细胞合成外，在小肠、脾、胰、胎盘、肾上腺等组织发现有LCAT的mRNA，推测也可合成LCAT。LCAT基因定位于16q22。全长约4600kb，由6个内函子组成。

HMGCoA还原酶（HMGCoa reductase）是胆固醇合成的限速酶，存在于小胞体膜，催化合成甲基二羟戊酸（mevalonic acid），并生成体内多种代谢产物，称之为甲基二羟戊酸途径。细胞内胆固醇水平调节主要信赖于内因性胆固醇合成途径和LDL受体摄取细胞外胆固醇的外因途径两条。Goldstein ,Brown阐明其抑制机制认为，细胞内ch作为HMGCoA还原酶抑制剂使其活性降低，肝细胞膜上的LDL受体增加，从血中摄取ch增加，使血中胆固醇水平降低，设想HMGCoA还原酶活性降低的药物可使血中胆固醇水平下降，尤其是对FH的杂合子患者，LDL受体数锐减者可起治疗作用。
Kovanen等报导以merinolin的HMGCoA还原酶抑制剂投入，使狗血中LDL消失速度上升，LDL产生速度下降，肝移植的小儿FH纯合子患者，用梅维诺林治疗可使LDL胆固醇降低40%，而LDL产生速度下降35%，LDL合成减少的机制，有两种可能，一是胆固醇合成减少使VLDL生成量降低；第二是HMGCoA还原酶抑制剂使VLDL残粒或βVLDL异化增加，转变成LDL减少，体外实验也证实，从VLDL残粒到LDL的速度比正常状态下小20倍，与此同时LDL受体的亲和力也增加。
仓鼠HMGCoA还原酶基因长30kb，由20个外显子组成，在启动子5'端富含GC碱基。HMGCoA还原酶，从转录水平作为胆固醇代谢的调节点，与LDL受体基因启动子，HMGCoA合成酶，从转录调节域存在有相同的碱基系列，即CACCCC（或GT）AC的胆固醇调节元件（sterol regulatory element,SRE）存在，如图5-5所示。
dongmaizhouyangyinghua027.jpg胆固醇代谢调节的启动子与SRE
图5-5 胆固醇代谢调节的启动子与SRE
第一条线的数字为从转录开始的距离（碱基对数）
（董学梅）

1．杨振华，酶的测定，见：叶应妩，李健斋，王玉琛主编。临床实验诊断学，北京：人民卫生出版社，1991，588～466
2．Paltarf F,Wagner E,Stereospecificity of Lipaseenzymatic hydrolyosis of enantiomeric aldyldiacyl and dialdylacylglyerols bylipoprotein lipase.Biochim Biophys Acta,1976,431:359-362
3.DeebSS.Peng R.Structure of the human lipoprotein lipase gene.Biochemistry,1989,1169:582-4134
4.GotodaT,et al.Anewly identified null allelic mutation in the human lipoproteinlipase(LPL)gene of a compornd heterozygote with familial LPLdeficienacy,Biochys Acta,1992,1169:582-586
5.OkabeT,Yorifaji H,et al .Pulmonary macrophage:Amajor source of lipoprtein lipase inthe lung.Biochim Biophys Res Commun,1984,125:273-278
6.OkaK,George T,Stocks J,et al.Nucleotide sequence of PvuⅡpoolymorphic site at the humanlipoprotein lipase gene locus .Nuceic Acids Research,1990,18:5407-5411
7.ChuatJ,Raisonnier A,Etienne J,et al.The lipoprotein lipase-encodigng humangene:sequence from intron-6 to intron-9 and presence in intron-7 of a40-million-year-old Alu sequence.Gene,1992,110:257-261
8.GotodaT,Yamada N,Murase T,et al .Detection of three separate DNA polymorphisms in thehuman lipoprotein lipase gene by gene amplfication and restriction endonucleasedigestion.J Lipid Res,1992,33:1067-1072
9.RajK,Edward W,Ruth M,et al .DNA variants at the LPLgene locus associate withangiographically defined severity of atherosclerosis and serum lipoproteinlevels in a welsh poprlation.Arteriosclerosis and Thrombosis,1994,14:1090-1097
10.RobertA,Andrew J,Liling T,et al .Agene-gender interaction affecting plasmalipoproteins in a genetic isoalate,Arteriosclerosis andThrombosis,1994,14671-677
11.YangC,et al.Lecithin:cholesterol acyltransferase.J Biol Chem,1987,262:3086-3091
12.Alberts J,Adolphson J,Chen C,et al.Radiommunoassay of human plasma lecithincholesterol acyltransferase.J Clin Invest,1981,67:141-148
13.McleanJ et al .Cloning and expression of human lecithin cholesterol transferase cDNA,Proc Natl Acad Sci USA ,1986,83:2335-2339
14.Glomset.J.Norum K,Gjone E,et al.Lecithin:cholesterol acyltransferase deficiency.In:TheMetabolic Basis of Inherited Disease.McGraw Hill ,New Youk,1983,643-654
15.GlomsetJ.The plama lecithin cholesterol acyltransferase reaction.J LipidRes,1968,9:156-167
16.HolmqusitZ,Carlson L.Normalization of high density lipoprotein in fish eye diseaseplasma by purified normal human lecithin cholesterol acyltransferase .Lipids,1988,23:225-229
17.ZilversmitD B.Atherogenic nature of triglycerides .postprandial lipidemia andtriglyceride-rich remnant.Clin Chem,1995,41:153-158
18.TakagiA, et al.Molecular strdies on primary lipoprotein lipase(LPL)deficiency:onebase deltion (G916)in exon 5 of LPL gene causes no detectable LPL protein dueto the absence of LPLmessenger RNA transcript.Jclin Invest,1992,41:153-158
19.JingamiR,Brown M,Goldstein J,et al .Partial deletion of membrane-bound domain of3-hydroxy-3methylglu-taryl coenzyme a reductase eliminates sterol enhanceddegradation and prevents formation of crystalloid endoplasmic reticulum,JcellBiol,1987,104:1693
20.GoldsteirJ,Brown M,Regulation of the mevalonate pathway.Nature ,1990,343:425-430
21.EastC,Grundy S,Bilheimer D,et al.Preliminary report:Treatment of ytpe 3hyperlipidemia with mevinolin.Metabolism,1986,35:97098-,104:1693
22.阵上久人，HMGCoa Reductaseとそのinhibiter .最新医学，1992，47：82-90