第九章 自由基与细胞凋亡

大气氧含量的变迁为生命的起源及生存创造了必须的条件。
生命的起源，历史上记录了许多企图回答这个古老的问题的答案，最具代表性的理论有三种：①特创论；②迁居论；③自然发生论。第一种解释特创论是生命起源归因于超自然力量的干预。圣经的《创世记》篇中关于创造世界的叙述就是特创论的一个例子这种理论显然是缺乏科学依据的。第二种解释是迁居论，迁居论假设认为，我位今天在地球看到的生命起源于从宇宙的另外地方的生命类型。这一假说远在19世纪经瑞典化学家Srante Arrhenius最先提出。按迁居论者认为，我们今天在地球上看到的生命。可能代表漫不经心地丢弃在垃圾里的细菌的后裔，这垃圾则是几十亿年以前从别的世界来的旅游者，在我们称之为太阳的恒星外数第三的行星（指地球）上停留期间进行野餐时遗留下来的，这种假想确实带有神话的色彩。目前的登月飞行，寻找外星有否生命存在，与迁居说有否联系，不得而知。第三种自然发生论是人们最感兴趣而有一定科学依据的假设。1924年Oparin提出生命起源于无生命物质。然而，生命的起源并不是一个能够追踪到特定的顷刻时间的突然事件。而是发生于地球上的一个经历了难以想像的漫长时间的逐渐的演变过程。Oparin和Haldane的化学进化假说新依据的设想是在适宜环境的影响下，所有这些重要的有机分子是可以形成的，并且随着时间的推移，这些分子就会发生一系列的相互作用，最后形成生命体系。当时这种假设并未被科学界马上接受，直至1953年，Stanley Miller利用自行设计的装置重建了含有甲烷、氨和水的原始地球大气，并加热到121℃（水在100℃时煮沸）24h灭菌，无菌之后，通过实验装置上部钟罩内包含的大气进行火花放电，经过七天之后，停止放电并分析实验装置中的内含物，以确定是否有有机化合物产生。七天后，在烧瓶内发现了许多象征生命系统特征的分子，有四种不同的氨基酸，尿素及其他化合物，在Miller的先驱性实验工作之后的年代中，别的实验工作在模拟原始地球的条件下，完成了不仅是简单的有机化合物，而且是更加复杂的分子生命系统中发现的原白质和核酸颇为相似。科学家们对Oparin-Haldane的生命起源假说是很认真的，他们的观点是把地球上生命的发展看作是特续达亿万年之久的化学进化过程的结果，这种观点是对生命起源的比较合理的解释。Oparin-Haldne学说的最重要的前提大气中氧气含量的变迁，为生命的起源创造了不可缺少的条件。正因为大气中氧含量经过亿万年的变迁，才进化到构成今日大气之大部分的氮气和维持生命的氧气，仅仅是原始地球大气的次要成分。因为原始地球表面是一个不毛之地的世界，它具有现在截然不同的的大气，有丰富的热能来源，它沐浴在紫外光之中，而且经受着当今世界所无法匹敌的巨大电暴。
地球上的生物在进化过程中，最初经化学进化合成简单有机物，如CH4、HCN及HCHO，从而演化产生厌氧生物。继之产生光合生物，它们利用这些有机物，并借助太阳能固定二氧化碳；其后又出现了篮藻，它是以水作为电子供体，进行光合作用生成氧的生物。篮藻使水受光氧化，造成地球大气O2的最初蓄积（图9-1）。在这之前，原始地球的大气成分中无游离O2，却含有具还原性的氢。这种环境变化，即游离O2作为光合作用副产品的不断产生，造成一种危机：生物只有逐步适应此含氧的大气才能生存，对于当时的原始生物来说，进入大气中的氧分子是一种“公害”，它使厌氧生物的生活圈逐渐限制在很狭小的范围，其巢穴越来越小。同时，因O2蓄积，形成臭氧层，290nm以下的紫外线不能到达地表，导致进入地表的能量减少，造成生物损害。结果，生活在深水中的生物生活圈必须扩大，从接近水面进而迁移到陆地，促进了对O2有抵抗性的生物的大发展。
dongmaizhouyangyinghua052.jpg地球大气氧浓度的变迁
图9-1 地球大气氧浓度的变迁
光合作用导致大气中大量蓄积O2，它不仅对厌氧生物，而且对需氧生物亦显示毒性。需氧生物不仅利用氧的过程中获得对付O2毒性的防御机能。而且还能把O2作为电子受体加以利用，获得高效率能源，使进行氧呼吸的需氧生物进化了一大步。氧气对生物的进化及生存是如此的重要，然而氧气也有对机损害的一面。主要通过氧自由基对机产生多种有利和有害的影响。

大多数化学键由双电子形成。这种键断裂时有二种可能：一种是异裂反应，成键的两个电子分给两种分裂产物之一，生成物为离子。另一种是均裂反应，两个电子均分给两个产物，此过程中产生的分裂物称为自由基（free-radical），在溶液中呈均一状态。自由基是指分子、原子或基团中有未配对电子的一类物质，如下述反应中的A·和B·，还有NO、NO2、I·及Na·等均具有未配对电子。绝大多数自由基寿命短，生成后不稳定，易被周围环境吸收。在化学反应机理的研究中，发现自由基参与的反应占相当大比例。
dongmaizhouyangyinghua053.jpg自由基

机体在代谢中不断地产生自由基，在酶催化的电子转移及氧化还原反应中，有许多自由基中间体参与；某些药物在体内以自由基中间体的活性形式发挥作用；在光化学反应及放射中多以自由基发挥作用。生物体的自由基可通过下面几种方式产生。
（一）放射线照射
放射性可直接或间接地对生物体发生作用，α-射线具有高能粒子作用，γ-射线具有电磁波作用，使生物体组织成分的分子激励或离子化；最终是化学键被切生成自由基，使机体被损害，这是放射线对生物直接作用的结果，这种方式是少量的。生物体内含有大量水，放射线首先使水分解，产生反应性非常高的自由基如H·和·OH等，H·和·OH可产生多种效应如破坏机体各组织细胞等，这是放射线对生物间接作用的结果。
生物体还被外部宇宙线、伦琴射线以及β射线包围，使生物体沐浴在大量射线之中，因而组织易遭损伤，加快老化的过程。
（二）机体周围自由基前身物的转变
我们周围环境有各种自由基或产生自由基的多种物质存在，如较稳定的氮氧化合物NO、NO2自由基，在大气中还有汽车排出的碳化氢，空气烟雾中的氟利昂等经太阳紫外线照射及光分解产生多种碳的自由基及卤原子；大气中的臭氧也可能转变成过氧化物自由基。食物中某些成分如茶叶在空气中放置过久，自由基含量会升高，还有一些脂类含有自由基的前身物以及过氧化物、某些药物、激素和类固醇等经机体摄取后，在代谢过程中也容易产生自由基。
（三）生物体内活性氧的生成
机体在代谢中不断产生的自由基，种类繁多，其中以活性氧最多。
1．活性氧种类：氧是偶电分子，分子中存在一个σ键和两个三电子π键，其简化结构式为dongmaizhouyangyinghua054.jpg。O2可呈现两种状态，即单线态（singlet state）又称为激发态，以1O2表示；另一种为三线态（triplet state），又称为基态，以3O2表示，3O2可吸收能量变为激发态；
3O2+hυ→1O2
氧化能力的指标是以氧分子的还原分子之间的标准氧化还原电位（E01）而定，如图9-1所示。
dongmaizhouyangyinghua055.jpg氧分子及活性氧相互间的标准氧化还原电位
图9-2 氧分子及活性氧相互间的标准氧化还原电位（pH7.0）O:1.0Atm
dongmaizhouyangyinghua056.jpg脂质过氧化反应及其脂质自由基的生成
图9-3 脂质过氧化反应及其脂质自由基的生成（LOOH、LOO、LO·）
氧是一个重要的电子受体，因所得电子数不同，氧可产生多种还原产物：O2-、·OH及H2O2，他们的E01均比O2高，具有强的氧化能力。
O2+e→O2-
O2+2e+2H+→H2O2
O2+3e+3H+→·OH+H2O
O2+4e+4H+→2H2O
不饱和脂肪酸在1O2等作用下，被氧化成过氧化脂（LOOH），LOOH又可进一步使脂肪酸氧化，脂质过氧化反应及其脂质自由基的生成如图9-3示。
以上所述的1O2、O2-、H2O2、·OH及LOOH等统称为活性氧，但是体内不能产生活性的O2+及原子氧。
基态氧本身毒性很低，但是O2-、H2O2、·OH、1O2及LOOH毒性较大，这种活性氧的毒害作用称为氧的毒性。
2．活性氧的生成性质
（1）超氧化物自由基（O2-）：O2-也可以HO2形式存在，HO2的pKa为8.4，在生理pH为7.45条件下，大部分以O2-形成存在，即HO2
dongmaizhouyangyinghua057.jpg
H++O2-。O2-是O2被一个电子还原生成，再由O2-产生其它活性氧，O2-是造成氧毒性的主要物质，在pH7.0时，O2-/O2和（2H+、O2-）/H2O2的E01相应为-330毫伏和+940毫伏，O2-既可起氧化作用，也可作为还原剂，当O2-作为还原剂时，产物为H2O2。
O2-的消除主要经超氧化物歧化酶（SOD）催化生成O2和H2O2：
dongmaizhouyangyinghua058.jpg
k=2.37×109M-1S-1,O2-也可自身进行歧化反应，反应速度相当慢：
dongmaizhouyangyinghua059.jpg
H2O2与O2-反应可生成反应性更高的HO·及1O2：
dongmaizhouyangyinghua060.jpg
O2-可被维生素C还原生成H2O2，维生素C使O2-还原的速度常数为2.7×109M-1S-1，与SOD催化的反应速度常数相当，细胞内维生素C浓度高，因此维生素C有与SOD同等程度消除O2-的作用。O2-还可被维生素E及谷胱甘肽（GSH）还原生成H2O2，GSH的-SH还原作用约相当于SOD的10%。
由于O2-寿命短，检测有一定困难，只能用电子顺磁共振波谱（ERR）检出。
（2）过氧化氢（H2O2）：H2O2可由O2-的歧化反应生成，在D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶及亚硫酸盐氧化酶等作用下，把O2作为电子受体，经两个电子还原生成H2O2，在线粒体中也能直接生成H2O2。H2O经放射线照射，一次生成·OH，再生成H2O2。
dongmaizhouyangyinghua061.jpg
H2O2较稳定，反应性低，在体内浓度也比较低，（大鼠肝脏中为10-9M），对机体几乎无毒性；H2O2可与铁离子生成反应性非常高的·OH：
H2O2+Fe2++H+→OH+Fe3++H2O
H2O2的消除依赖于两种酶，一是过氧化氢酶，催化H2O2歧化反应：2H2O2→2H2O+O2；二是谷胱甘肽过氧化物酶。在GSH参与下使H2O2分解，GSH则变成氧化型谷胱甘肽。这两种酶可消除体内H2O2及过氧化物，防止血红蛋白及肝细胞膜部分被氧化破坏的可能。
（3）氢氧自由基（·OH）：体内·OH从O2直接生成的反应尚不清楚，机体可由O2-生成系与H2O2生成系共同形成·OH自由基。水经放射线照射后的一级反应产物是·OH，由于·OH氧化能力很强，因此对机体毒性很大。
H2O2+Fe2++H+→OH+Fe3++H2O
H2O2+O2-+H+→·OH+H2O+O2-
·OH在水中寿命很短，一般不易以自旋共振（ESR）方法检出，有人利用DMPO（5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）作自旋捕获，成功地检出白细胞内产生的·OH，因DMPO与·OH形成一个较稳定的加成物DMPO-HO·。另外也可采用生物反应检出。
dongmaizhouyangyinghua062.jpg
（4）单线态分子氧（1O2）：1O2是一个强的亲电子性的氧化剂，可用化学方法生成，也可由H2O2经氧化生成，即H2O2由次氯酸氧化生成1O2：
NaClO+H2O2→1O2+NaCl+H2O2
1O2可与芳香族碳氢化合物进行一系列的反应。
1O2可将能量转移给其他物质而变成3O2，在此过程中，物质（A）作为1O2的淬灭剂，接受能量变为激发态（A*），然后以热的形式放出能量回到基态A。水也可作为1O2的淬灭剂。
dongmaizhouyangyinghua063.jpg
由于 1O2在水中寿命短，要检测出1O2有一定困难，最直接的证明是经1O2→3O2+hυ的化学发光观察，1O2单分子发光波长为1269微米及760微米。1O2的寿命在D2O中比在水中长10倍，以此均可证明1O2的存在。最近有人利用光子计数器检测微粒体中产生的1O2已获得成功。
（5）过氧化脂类：人体内主要有亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸，多以磷脂形式存在于质膜等生物膜中。这些不饱和脂肪酸可受1O2氧化，也可经·OH氧化生成过氧化脂质，生物膜上脂类既可在O2-作用下生成过氧化脂质（LO·、LOO·、LOOH），也可经放射线照射生成脂类自由基（L·），这种在脂类中微量存在的L·，在氧参与下进行链锁反应，加速过氧化过程，如图9-3所示。过氧化脂质化学性质活泼，易进一步使脂类分解引起自由基反应，也可使GSH氧化，而本身变成较稳定的脂类羟基化合物（LOOH）。
氧自由基的生成、氧化还原及激发过程如图9-4所示。
dongmaizhouyangyinghua064.jpg过氧化脂质使氧自由基的生成、氧化还原及激发过程

生物体内具有防御自由基毒害的抗氧化剂或抗氧化酶。

SOD是催化O2-歧化反应的酶类，这种歧化反应属于自身氧化还原反应，O2-的歧化反应在H-存在下，经SOD催化，一半O2-氧化为O2，O2-的另一半还原为O22-。
SOD+O2-→SOD-+O2
SOD-+O2-+2H+→SOD+H2O2
（SOD：氧化型，SOD-：还原型）dongmaizhouyangyinghua065.jpg
SOD是生物对抗O2-毒性的酶，产物之一H2O2又可与O2-相互作用（Haber-Weins反应）产生OH·，借以清除细胞内O2-。缺氧条件下，培养的大肠杆菌里SOD含量少；有氧条件下，培养的大肠杆菌里SOD含量高。如果将上述两种大肠杆菌置于20个大气压的O2及N2条件下培养，当即见到无O2条件下预先培养的大肠杆菌迅速死亡；有O2条件下，预先培养的大肠杆菌对O2有抵抗性，因此，SOD在防止O2-的毒性方面具有重要意义。
SOD有含Cu、Zn的SOD（Cu、Zn-SOD），含Fe的SOD（Fe-SOD）及含Mn的SOD（MnSOD）三种存在形式。生物界中，细菌等原核生物及线粒体含有Fe-SOD和Mn-SOD，与高等动物所含的Cu、Zn-SOD相比，其蛋白质部分截然不同。目前从牛红细胞中提取了比较多的Cu、Zn-SOD，其结晶纯品已开始用于临床。各种SOD进行的歧化反应稍有不同，Fielden等测出Cu、Zn-SOD中的Cu有1/4处于还原不被氧化状态，这是因为有一部分Cu与O2-进行反应，另一部分处于非反应状态。
dongmaizhouyangyinghua066.jpg
Pick等测出大肠杆菌的Mn-SOD对O21的催化反应有两种速度，推测Mn-SOD以三种形式存在并参与反应。
Fe-SOD参与反应的机制与Cu、Zn-SOD一样按两步进行：
dongmaizhouyangyinghua067.jpg
SOD生理功能可归纳为：保护细胞，对抗氧的毒性；有助于H2O2浓度的调节，对付微生物的侵害。

维生素E又名生育酚，天然的生育酚有七种，其中分布最广泛的是α-生育粉，具有抗氧化作用。维生素E可抑制肝细胞内微粒体的过氧化脂类的生成。据报道，给予鼠维生素E有延长寿命的作用，在胎儿成纤维细胞传代培养中，给予维生素E者，传代数增加，可抑制过氧化脂类生成，其原因是作为生物体内自由基淬灭自由基（LOO·）生成的苯羟自由基的过程可被巯基化合物还原，特别是被GSH还原成生育酚，从而使生育酚能更有效的发挥作用。
dongmaizhouyangyinghua068.jpg
维生素C也有与维生素E同样的作用，然而维生素E是脂容性，维生素C是水溶性，基作用场所不同，维生素C可使水中自由基淬灭，在防止膜受攻击上有重要意义。

体内H2O2可被氧化酶和氧化物酶转变为H2O2消除H2O2的毒性。过氧化氢酶可催化两两分子H2O2生成H2O2和O2过氧化物酶利用H2O2直接胺类等物质，某些组织中含有一种含硒的谷胱氧化酶，可使LOOH或H2O2与GSH反应将LOOH变成无毒的醇类。
dongmaizhouyangyinghua069.jpg
活性氧的代谢途径及清除体系如图9-5所示。
dongmaizhouyangyinghua070.jpg活性氧的代谢途径及清除体系
图9-5 活性氧的代谢途径及清除体系
←：活性生成反应；□：活性氧；：清除酶系；AH：清除低分子化合物；AH：电子供体

天然的低密度脂蛋白（LDL）经氧化修饰形成的脂蛋白，称为氧化低密度脂蛋白（OxLDL）。天然LDL核心的脂肪酸中含有大量不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）约占LDL总脂肪酸含量的35%～70%，所以容易发生自身氧化。
LDL中的PUFAs在自由基或其他氧化剂作用下，生成脂类自由基，并能产生更多的过氧化脂质，引起连锁的自由基链式反应，最终生成多种反应性的醛。这些化学性质活泼的醛和ApoB发生结合，产生新的抗原决定簇，形成氧化LDL。OxLDL与动脉粥样硬化关系密切。

从动脉粥样硬化发病机制，我们不难发现LDL在动脉粥样硬化发生、发展中起非常重要的作用。
（一）内皮细胞俘获LDL和巨噬细胞泡沫化
高脂血症、脂质代谢失常是动脉粥样硬化的重要病因。血浆中增多的脂质以LDL的形式经完整的内膜侵入内皮下，这一过程呈现LDL浓度依赖性，无需受体介导。另有观点认为，机械因子、化学因子、免疫因子、毒素或感染因子对内皮的损伤，导致LDL-胆固醇摄取增多。这又反过来会改变内皮细胞和循环血细胞（单核细胞、血小板）的表面特性，促进单核细胞粘附于血管内皮，并转变为巨噬细胞，转变后的巨噬细胞更有能力摄取更多的脂质，在内皮下被俘获的天然的LDL可以经历两种形式的修饰，即衍化和氧化，如图9-6所示。
dongmaizhouyangyinghua071.jpg
图9-6 LDL的修饰在内皮下间隙，被俘获的天然的LDL可能经历两种形式的修饰-衍化（MAD粘附于ApoB-100或者ApoB-100的糖基化）、氧化（ApoB-100被过氧化物降解），分别形成衍化的LDL和氧化的LDL。
天然LDL在正常情况下，由LDL受体识别。LDL和LDL受体结合后，内吞入细胞，与溶酶体结合。在溶酶体酶的作用下，蛋白质降解为氨基酸，胆固醇酯水解为游离胆固醇和脂肪酸。此受体受到细胞内胆固醇含量的下降调节，当细胞内胆固醇的含量增多时，LDL受体的量便会减少。所以，天然LDL经这一途径代谢，不会引起胆固醇酯在细胞内堆积。
LDL还可以通过清道夫受体途径代谢。这一受体主要参与修饰的LDL的代谢，没有下降调节的特点，不受细胞内胆固醇的含量的应答。通过此途径，修饰LDL被摄取和降解的速度都比正常LDL快。所以LDL这一代谢途径直接参与动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成，如图9-7所示。
dongmaizhouyangyinghua072.jpg
图9-7 泡沫细胞的形成巨噬细胞通过修饰LDL受体途径摄取（消化）修饰的LDL。导致大量的负荷脂质的小滴进入，泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化进程中脂肪纹形成的标志。
（二）LDL的氧化修饰
1．LDL氧化修饰的形式
（1）细胞介导的LDL氧化修饰
1981年，Henriksen等人将兔主动脉内皮细胞和LDL孵育一段时间后，发现该LDL被巨噬细胞摄取的速度较未与内皮细胞共同孵育的LDL快，而且在孵育的基质中发现了硫代巴比妥酸反应物（TBARS），据此，认为内皮细胞可以氧化修饰LDL。这是细胞介导的LDL氧化修饰，又称生物氧化修饰的LDL。后来发现除内皮细胞外，巨噬细胞、血管内膜平滑肌细胞、单核细胞都可以氧化修饰LDL。
（2）过度金属离子介导的LDL氧化修饰
过度金属离子Ca2+、Fe2+等，在体外适宜条件下与LDL孵育一段时间后，也能使LDL发生氧化变构。因为这是利用化学物质氧化LDL，故称为化学氧化修饰的LDL。
（3）其他形式的氧化修饰
还可以使用物理学方法如紫外线、钴60对LDL进行氧化修饰。利用过氧化酶类也可能使LDL转变成OxLDL。
2．氧化修饰的过程
LDL的氧化可人为划分为三个阶段。最初为迟滞阶段，消耗内源性抗氧化剂（VitE）；增殖阶段，PUFAs快速氧化为脂质氢过氧化物；分解阶段，脂质氢过氧化物转变为反庆性的醛。这些醛包括丙二醛（MDA）、4-羟烯酸（4-HNE）等，并可以和ApoB发生共价结合（主要和ApoB的赖氨酸残基结合），形成新的抗原决定簇。OxLDL丧失与天然LDL受体结合的能力，被清道夫受体所识别。
3．氧化修饰后LDL理化的生物学特性
OxLDL不同于天然LDL。OxLDL内维生素E含量下降，游离氨基减少，琼脂糖电泳速率增快。LDL中所含的大量卵磷脂转变为溶血卵磷脂。氧化修饰程度低时，ApoB以分解为主。修饰程度高时，降解的ApoB又可重新聚合成大分子。氧化LDL还具有一系列生物学毒性作用。氧化修饰后的LDL不能经LDL受体代谢，由清道夫受体识别、结合、内吞饮入细胞并丧失正常的胆固醇代谢途径，引起细胞内脂质沉积，泡沫样变。
4．修饰的LDL和氧化修饰的LDL的区别和联系
氧化的LDL是修饰LDL中的一类。修饰的LDL除包括氧化修饰的LDL外，还包括乙酰化LDL及丙二醛、4-羟烯酸直接结合的LDL，我们称这些未经氧化修饰，而仅经一般化学修饰的LDL为衍化的LDL。
衍化的LDL和OxLDL都可以被清道夫受体识别，导致泡沫细胞的形成。在过去的很长一段时间里，我们将一般化学修饰的衍化的LDL和OxLDL混为一谈。特别是认为氧化LDL就是MDA-LDL。但实际上，MDA-LDL不同于OxLDL。
用Ca2+引发LDL的氧化修饰，比较氧化修饰的LDL与脂质过氧化降解产物MDA修饰的LDL之间的差别。发现氧化修饰LDL和MDA修饰LDL都产生类似于脂褐质的荧光物质，都可使LDL上的游离氨基减少，琼脂糖电泳速度加快，且游离氨基减少量与电泳迁移率增加呈正相关。但两类不同的修饰LDL之间也有差异,主要表现在：①对细胞生理功能影响不同。氧化LDL可诱发细胞毒性作用，影响花生四烯酸的代谢，抑制胆固醇酯化作用等，而一般化学修饰的LDL则无上述效应；②氧化修饰消耗LDL内源性抗氧化物质，使LDL上的维生素E含量下降，而MDA修饰无上述改变；③氧化修饰涉及脂质过氧化反应，LDL中的PUFAs被氧化。MDA对LDL修饰，是直接和ApoB-100结合成希夫氏碱，脂质过氧化反应轻微；④氧化LDL在氧化程度低时，ApoB降解，在氧化程度高时，ApoB又可发生再聚合。MDA对LDL的修饰，ApoB无降解、聚合反应发生；⑤氧化LDL产生的荧光峰波长为430nm，而MDA修饰LDL的荧光峰波长为460nm。这些差异可能是由于两类不同的修饰对LDL结构与组成影响不同，提示我们不能简单地把脂质过氧化降解产物修饰的LDL等同于OxLDL。

OxLDL由清道夫受体识别并进一步代谢。清道夫受体可能是多种受体的总称，据报道，除乙酰化LDL的受体外，Fcr受体和CD36受体也能介导OxLDL的摄取和降解。现已证实分离纯化的清道夫受体是由3个λkD的亚单位构成的糖蛋白，存在于细胞表面，聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为2.2×105左右。清道夫受体可以和乙酰化LDL、OxLDL以及诸如次黄嘌呤核苷酸、丝氨酸磷脂等配体结合。这些物质的共同特点为多阴离子化合物。正常LDL受体是通过识别ApoB上由赖氨酸、精氨酸、组氨酸共同构成的正电荷区与LDL结合的。LDL氧化后，产生的反应性醛和LDL的ApoB的赖氨酸残基的ε氨基结合，使LDL失去一些正电荷，带上多量负电荷。这样OxLDL不能再被LDL受体识别，而被清道夫受体结合。而且OxLDL摄入速度是天然LDL的3～10倍，并且不受细胞内胆固醇含量的应答。
巨噬细胞和内皮细胞对不同氧化程度的LDL的结合和降解量是不同的。总的来说，随着氧化修饰程度的升高，巨噬细胞和内皮细胞对LDL的结合和降解随之升高。将LDL与Ca2+孵育，LDL经氧化后得到琼脂糖迁移率（Rf）分别为1.33、1.67、2.33的氧化LDL。研究巨噬细胞和内皮细胞对这几种不同氧化程度的LDL的结合和降解，发现当LDL修饰程度很低（Rf=1.33）时，OxLDL被巨噬细胞结合和降解的量接近、甚至低于天然LDL，而当修饰程度高时，被巨噬细胞和内皮细胞结合和降解的量随之升高，而且明显高于正常LDL（图9-8、图9-9、图9-10、图9-11）。
另有报道，正常细胞摄取OxLDL时，LDL受体与清道夫受体起协同作用。因为氧化程度不同。OxLDL的ApoB上可能残留多少不等的LDL受体识别位点。用单抗封闭这些位点时，细胞对OxLDL结合量和降解量下降。

（一）动脉粥样硬化损伤灶存在OxLDL
有学者发现人、兔动脉粥样硬化斑块处分离出的LDL的特性与OxLDL相似，包括电泳速度加快、ApoB降解等。而正常动脉壁处LDL无此特性。
最近，生产出的针对MDA-ApoB的单克隆抗体和MDA-VLDL、MDA-HDL、MDA-白蛋白不发生交叉反应。利用特异性抗原抗体反应推测来源于冠心病人的组织标本，发现在平滑肌细胞、巨噬细胞来源的泡沫细胞中和斑块核心脂质中都有免疫反应发生，而且在人、兔的动脉粥样硬化病灶区存在抗OxLDL的自身抗体。
（二）血浆中是否存在OxLDL
抗MDA-LDL自身抗体的滴度可用来预测冠状动脉粥样硬化进展。然而这些抗体和蛋白质（如蛋白）中MDA-赖氨酸加合物发生交叉反应。目前，尚没有血浆中存在OxLDL的直接证据，血浆中存在脂质过氧化物和TBARS，它们的含量可以用脂质TBARS荧光微量测定法测量。它们可能是氧化LDL的裂解片段。
有学者制备抗OxLDL的单抗，推测血浆中OxLDL的含量，并通过临床试验证实冠心病患者血浆中OxLDL浓度高于正常人。然而，由于血浆中是否存在OxLDL有待证实，故这种检测方法是否能够用于动脉粥样硬化的辅助诊断有待证实。

OxLDL可以通过以下途径促进动脉粥样硬化的发生、发展。
（一）参与泡沫细胞的形成
在早期的动脉粥样硬化损伤中，发现负荷脂质的泡沫细胞在动脉内膜下集聚。这些泡沫细胞主要来源于摄取OxLDL的单核/巨噬细胞。内皮下泡沫细胞的堆积在动脉粥硬化起因中有关键作用。
MarileeLoughecd等认为氧化LDL能抵抗组蛋白酶，从而抵抗溶酶体对OxLDL的降解，在细胞内堆积。当然，细胞内胆固醇量对清道夫受体的非下降调节是细胞泡沫化的主导原因。这些泡沫细胞以大量的二级溶酶体和胞浆脂滴为特点。脂质在泡沫细胞中沉积的结果使得动脉壁从最初的脂肪纹发展到更复杂的纤维斑块和粥样斑块。这些斑块最外层富含巨噬细胞来源的泡沫细胞，易于发生斑块破裂，引起血栓形成。
（二）促进细胞粘附和巨噬细胞源性泡沫细胞的产生
1.促进单核细胞的粘附和泡沫细胞的产生
单核细胞对动脉内皮粘附的增多是实验动物动脉粥样硬化早期表现之一。氧化LDL可以通过剌激细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达，使单核细胞，中性白细胞和淋巴细胞与内皮结合的数量增多，而且这种结合表现出高亲和力。还可以剌激内皮白细胞粘附分子-1（VCAM-Ⅰ）的表达，导致单核细胞的粘附移行。而且，OxLDL还能促使内皮细胞和血小板产生一种分子量为140kDa的颗粒膜蛋白（GMP140）。这种颗粒膜蛋白能在细胞激活的基础上快速翻译到细胞膜上，结合中性白细胞和单核细胞。微氧化的LDL，不能被清道夫受体识别，但它已能剌激特定的单核细胞粘附分子的表达。
单核细胞粘附于内皮后移行入内膜。内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞分泌特定趋化剂，如单核细胞趋化剂1（MCP-1），MCP-1的合成受OxLDL的剌激。
dongmaizhouyangyinghua073.jpg单核细胞源泡沫细胞的产生
图9-8 单核细胞源泡沫细胞的产生
ECAM-1，内皮白细胞粘附分子-1　1CAM-1，细胞间粘附分子-1
VCAM-1，血管细胞粘附分子-1MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1
M-CSF，单核细胞集落剌激因子　GM-CSF，粒细胞-单核细胞集落剌激因子
氧化LDL剌激内皮细胞分泌粘附分子（ECAM-1、ICAM-1、VCAM-1），内膜单核细胞的增生受特定集落刺激因子（GM-CSF、M-CSF）的诱导。继而单核细胞分化为巨噬细胞并分泌特异的针对单核细胞的趋化剂（MCP-1）。进而，巨噬细胞通过清道夫受体聚积OxLDL，转变为泡沫细胞。
OxLDL激活内皮细胞，促使趋化因子、粘附分子、粒细胞一单核细胞集落剌激因子（GMCSF）和单核细胞集落剌激因子（M-CSF）分泌。所有这一切都会剌激巨噬细胞的增生和分化。M-CSF诱导巨噬细胞表面清道夫受体的表达，使OxLDL摄取增多，巨噬细胞泡沫化（图9-8）。
2．促进中性白细胞粘附
研究发现注射OxLDL，可在体外诱导内皮结合白细胞，Lehr等人进一步证实这一作用涉及血小板活性因子受体和CD11b/CD18粘附受体复合物。
（三）诱导平滑肌细胞增生、移行，产生平滑肌细胞源性泡沫细胞
OxLDL通过诱导巨噬细胞和平滑肌细胞产生血小板源生长因子（PDGF），促进平滑肌细胞移行。通过诱导内皮细胞产生碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），促进平滑肌细胞增生。最终，OxLDL诱导平滑肌细胞表面清道夫受体的表达，导致平滑肌细胞内吞OxLDL，继而产生平滑肌源性泡沫细胞（图9-9）。
dongmaizhouyangyinghua074.jpg平滑肌细胞源泡沫细胞的产生
图9-9 平滑肌细胞源泡沫细胞的产生
bFGF，碱性成纤维细胞生长因子
PDGF，血小板源生长因子
OxLDL引起平滑肌细胞从中膜移行入内膜，结果内膜增厚。激活平滑肌细胞和巨噬细胞分泌PDGF和bFGF，它们可诱导平滑肌细胞增生和移行。而且bFGF诱导清道夫受体表达。通过这些受体，平滑肌细胞聚积OxLDL，转变成泡沫细胞。
（四）促进血小板粘附、聚集、血栓形成
OxLDL抑制内皮细胞衍生的舒张因子（EDRF）或NO的合成，损伤动脉壁正常的舒张功能。而且OxLDL中的溶血卵磷脂诱导合成内皮细胞衍生的收缩因子（EDCF），诱使血管收缩。
氧化LDL可以促使血小板聚集、增强花生四烯酸代谢及血栓素B2（TXB2）的产生，减少膜脂流动性。OxLDL抑制前列腺素I2合成酶，使前列腺素I2（PGI2）合成减少，激活血小板环氧化酶，使血栓素A2（TXA2）产生增加，破坏了PGI2/TXA2平衡，促进血小板聚集，引起血管痉挛和血栓形成。
（五）损伤内皮细胞
内皮细胞的损伤和功能改变是动脉粥样硬化发生的基础。内皮细胞的损伤在动脉粥样硬化的发病机理中作为起始机制，被认为具有重要作用。多种研究提示内皮细胞对自由基和脂质过氧化作用非常敏感。
LDL氧化过程中产生的脂氢过氧化物可以直接损伤内皮细胞。OxLDL可使内皮细胞对LDL的通透性增高，胞浆发生空泡变性，浆膜皱缩，甚至可使细胞最终坏死。内皮细胞受损又使内皮细胞保护剂PGI2的合成进一步减少，促进中性粒细胞对内皮的粘着及呼吸爆发，促进血小板在内皮聚集、释放O2-，进一步加重内皮损伤。
OxLDL对细胞的毒性无需受体介导。细胞对OxLDL的易感性取决于细胞分裂所处的细胞周期和细胞内谷胱甘肽的含量。丙丁酚可转移并渗入细胞膜作为一种捕捉自由基的抗氧化剂对抗氧化压力。细胞和OxLDL孵育会使基质中TBARS增多。这以上二点似乎提示内皮细胞膜自由基反应特别是脂质过氧化，与OxLDL激发的内皮细胞损伤有关。内皮细胞膜脂质过氧化降低膜脂质流动性，增加膜对离子渗透性，抑制膜结合酶活性。OxLDL怎样诱导细胞膜脂质过氧化，还不清楚。
（六）产生抗OxLDL的自身抗体
在兔和人的血清中都发现了抗OxLDL的自身抗体，且抗体的滴度和心血管动脉粥样硬化进程密切相关，表明免疫机制在动脉粥样硬化发病机理中起了作用。
最近还发现粥样斑块区的炎性浸润物包含T淋巴细胞和B淋巴细胞。这些T淋巴细胞主要是由局部抗原激活的淋巴细胞。斑块区沉积的胆固醇还能通过诱导人类主要组织相容性Ⅱ类抗原表达，加强巨噬细胞呈递抗原的功能。
OxLDL通过以上多种途径在动脉粥样硬化的起始和进展中发挥了举足轻重的作用。
既然OxLDL和动脉粥样硬化的关系如此密切，那么抗LDL的氧化修饰就成为阻断动脉粥样硬化进程的关键环节。有可靠的证据表明LDL的氧化修饰，只有在LDL内源性、亲脂性抗氧化剂消耗殆尽后才会发生，其中维生素E作为第一线抗氧化剂，β-胡罗卜素作为抗LDL氧化的最后一层屏障。如果的确是这样，就可以解释摄食的抗氧化剂的血浆水平为什么和心血管疾病的危险性呈负相关。流行病学研究也进一步表明血浆中维生素E水平高的人群，心血管疾病患病的危险性低。这些研究给动脉粥样硬化的预防和治疗提供了新的思路。

Humphrey于1935年在研究“笑气”（N2O）时发现一氧化氮(nitricoxide,NO)以来，NO一直被看作是对生物有毒的简单无机分子。NO在常温下为气体，水中溶解度很小，仅1mmol/L，极易透过细胞膜扩散，NO拥有额外电子，具有高度的化学反应能力，在生物组织中半寿期仅有几秒种。近年来研究表明，NO作为可能的突触前递质和突触后逆信使在神经系统信息传递和发音中起作用；NO作为生物信使分子也在机体免疫和血液血压调节中起着重要作用。
一、NO的自由性质
在NO分子中，N原子外层有五个电子，O原子外层有六个电子，形成共价键后，在分子轨道上含有不成对电子（：N：：O：），因此它是自由基，不稳定，半寿期短，易生成过氧亚硝基阴离子ONOO-，质子化后很快分解生成HO和NO2自由基，在生物体内还可生成一系列的具有生物功能的自由基和硝基化合物。
二、NO的生成
NO在体内经一氧化氮合酶（nitricoxide synthase,NOS）的作用才能生成。NOS以L-精氨酸（L-Arg）和分子氧为底物，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）为辅因子提供电子，由黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四喋呤传递电子，生成中间体对羟基-精氨酸，然后形成NO和L-胍氨酸（L-Citr），其中NOS是NO生成的最主要的限速因子。
dongmaizhouyangyinghua075.jpgNO的生成
三、一氧化氮合酶
NOS由1025个氨基酸残基组成，分子量为13.3kD。NOS广泛分布于机体内。按其存在的细胞类型不同，NOS可以为三种类型，即神经型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。nNOS存在于视网膜、植物神经纤维、大脑皮层、海马、垂体后叶、丘脑、嗅球区粒细胞层、骨骼肌细胞和平滑肌细胞。iNOS存在于肝细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞。eNOS存在于血管内皮、支气管内皮和海马锥体细胞层。按同工酶分类，NOS可分为同工酶Ⅰ（NOSⅠ），又称为神经型（nNOS），主要分布在神经元的上皮细胞中。同工酶Ⅱ（NOSⅡ），又称为诱导型（iNOS），主要分布在细胞因子诱导的巨噬细胞中；同工酶Ⅲ（NOSⅢ）又称为内皮型（eNOS），主要分布在内皮细胞中。
利用特异的DNA探针已经证明NOSⅠ、Ⅱ、Ⅲ基因分别定位于12号（12q24.2～24.3）、17号（17p11～17q11）、7号（7q35～36）染色体。
根据克隆及cDNA结果推测，NOSⅠ的mRNA长度＞10kb，而其编码基因＞100kb，其基因详细结构不清楚。人NOSⅡ基因全长37kb，由26个外显子组成，人NOSⅢ基因全长21kb，由26个外显子组成。

细胞凋亡（apoptosis）是细胞的主动死亡，它参与机体许多生理和病理过程，并起着调节作用。

细胞凋亡是Kerr等于1972年首先提出的一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，它具有特征性形态和生化改变，是细胞自身主动死亡的过程，又称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），生命体内细胞死亡有两种完全不同的形式，当细胞遭受急性和严重损害时，细胞肿胀破裂，胞液外溢导致周围组织发生炎症，即坏死过程。细胞在正常死亡时，出现细胞收缩，细胞核成片状，电镜可见到细胞膜上有很多的小泡生成。DNA电泳区带呈梯状，这种方式称为细胞凋亡。细胞凋亡是指细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，参与胚胎发育及变形胸腺细胞的克隆选择、细胞介导的细胞毒作用、衰老造血细胞的清除、肿瘤发生、人类免疫缺陷、病毒感染及化学治疗等。因此，对细胞凋亡的研究成为免疫学、细胞生物学、肿瘤学和分子生物学等领域的热门课题。

众所周知，氧化还原反应是人体内最为广泛和重要的化学反应，自由基尤其是活性氧（reactive oxygen species, ROS）及其衍生物自由基是氧化反应中的重要成分。ROS与衰老密切相关，而衰老细胞的死亡实质上就是细胞凋亡。
目前，研究较多的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）是由巨噬细胞和单核细胞产生，激活TNF受体可使细胞内ROS明显增加。体外试验表明TNF能诱导细胞凋亡，细胞对TNF的敏感性还与SOD的降低有关，如缺乏SOD的T细胞对TNF、电离辐射和高温引起的细胞凋亡更敏感。
据报道，能引起细胞氧化的因素均能引起细胞凋亡。电离辐射和紫外线照射能通过直接攻击水分子而在水中产生·OH，并能诱导细胞凋亡，如图9-10所示。H2O2在体内Fe2+分子反应生成超氧阴离子O2-和H2O2，通过对巨噬细胞和单核细胞的研究，Albina等提出NO也是细胞凋亡的诱导剂。抗肿瘤药物如阿霉素和顺铂等虽然本身不是自由基，但是它们可以引起ROS的增加；而另一种药物如Bathionine Sulfoxamine等则能消耗细胞内GSH，两类抗肿瘤药物能使细胞对多种因素诱导的细胞凋亡更敏感。
dongmaizhouyangyinghua076.jpg氧化诱导细胞凋亡的机制及其调节
图9-10 氧化诱导细胞凋亡的机制及其调节
（源自：陆怡等生物化学与生物物理进展.23（2））
现已报道，有25个癌基因与细胞凋亡有关。与自由基尤其是氧化关系最密切的是bcl-2基因，bcl-2基因是人类发现的第一个死亡抑制基因。已证实，bcl-2基因表达能抑制多种因素（电离辐射、高温、GSH合成抑制剂、生长因子缺乏）引起的细胞凋亡，其机制不清，Kane等报导，bcl-2的表达并不能增加细胞SOD活性，可能是通过阻断电子传递链中ROS的产生，或者起了ROS清除剂的作用而调节细胞的氧化还原状态，从而调节细胞凋亡。

细胞凋亡相关基因大致可分为两大类，即凋亡促进（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它们分别起着促进凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之间还存在一定的相互关联。
1．凋亡促进基因
凋亡促进基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGFβ等。其中ced-3，4是在线虫索中发现的，而p53、ICE等存在于哺乳动物中。p53为肿瘤的抑制基因，分为两型，一型是使细胞周期停止在GI期，抑制细胞繁殖的野生型；另一型是具有突变能力的变异型。野生型p53可诱导易感细胞发生凋亡。白介素1β转换酶（interlukin 1-β-converting enzyme, ICE）,与线虫细胞凋亡相关基因ced-3有较高的同源性，具有直接诱导细胞凋亡的作用。Bax和bcl-Xs均为bcl-2基因家族成员，两者可结合形成二聚体或异体二聚体，两者之间的比例决定了细胞的命运。若Bax占多数，则bcl-2被抑制，诱导细胞死亡；反之，则Bax受到抑制,细胞得以生存。
2．凋亡抑制基因
凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是当前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一种，在人体多种形态的肿瘤中过度表达，可抑制由多种剌激包括化疗和放疗引起的细胞凋亡。bcl-2常在淋巴细胞系统（胸腺、脾、淋巴结）和神经系统（右脑、中脑，小脑）中表达，抑制该部位的细胞凋亡。淋巴性白血病细胞中bcl-2也是过度表达的。Bcl-X1也是bcl-2家族成员，是由bcl-X编码的两种不同bcl-XmRNA而产生。bcl-X1有抑制神经细胞凋亡的作用。

Forrest等[3]发现H2O2诱导的细胞凋亡中，让H2O2作用于细胞膜两h后，用膜保护剂Trolox（VitE类似物）能阻止细胞凋亡的发生。由于ROS很容易与膜的多聚不饱和脂肪酸（PUFA）和胆固醇反应，引起氧化链式反应，因此膜脂质过氧化以后才有DNA损伤、细胞损害。最近Isabelle等[5]报道，氧化低密度脂蛋白（OxLDL）可诱导细胞凋亡。
自由基尤其是ROS具有很强的生物活性，很容易与生物大分子反应，直接损害或者通过一系列过氧化链式反应而引起广泛的生物结构的破坏。为了减少有氧代谢过程中自由基对细胞的损害，细胞内有一系列有效的抗氧化防御机制，包括清除ROS的SOD、过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）、硫氧还原蛋白（phioredoxin）等和阻断过氧化链式反应的生育酚、胡罗卜素和抗坏血酸等。通常细胞处于氧化与抗氧化平衡中而维持着正常的功能。一旦氧化与抗氧化作用失衡，细胞的功能将会受到影响，细胞凋亡可能就是这种失衡的结局之一。
（周翔　郑芳）

1．周新，自由基及其对机体作用，见：徐学峰主编，生理生化学与医学（第二版），北京：科学出版社，1987年，504-515
2．周新，红细胞代谢的某些进展，见：生物科学参考资料（第七集）。北京：科学出版社，1977，23-41
3．周新，超氧化物歧化酶化与活性氧，国外医学分子生物学分册，1980，2：84-89
4．惠宏襄，赵小宁，金明，等，自由基与细胞凋亡，生物化学与生物物理进展，1996，23：12-16
5．陆怡，潘华珍，许彩民，氧化与细胞凋亡，生物化学与生理进展，1996，23：118-121
6．Southorn PA,Powis G,Free radicals in Medicne Ⅱ,Involvement in Human Disease MayoClin Proc,1988,63:390-408
7.MitchelJD,et al.Cu/Zu Superoxide dismutase ,free radicals ,and motor neurone disease.Lancet ,1993,342:1051-1054
8.FecondoJV,Auqusteyn R,Superoxide dismutase ,catalase and glutathione peroxidase in thehuman cetaractous lens.Exp Eye Res,1983,36:15-23
9.HalliwellB,et al.Free radicals and human disease where are we now J.Lab ClinMed,1992,119-:598-620
10.LeffJA,et al .Serum antioxidants as predictors of adult tespiratory distresssgndrome in patients with sepsis,Lancet ,1993,341:777-780
11.RimmEB,et al .Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in menNew Eng J Med ,1993,328:450-456
12.WitztumJL,Steinberg D.Role of low density lipoprotein in atherogenesis .J ClinInvest,1991,88:1785-1792
13,NeveJ.et al Usual values for selenium and glutathione peroxidase in a belgianpoprlation .Am Biol Chem,1989,47:138-143
14.BlockG.A role for antioxidants in reducing cancer risk .Nutr Rev,1992,50:207-213
15.CeruttiPA.Oxy radicals and cancer .Lancet ,1994,344:862-863.
16.StampferM,et al.Vitamin E consumption and the risk of coronary disease in women.New EngJ Med ,1993:1444-19449
17.PetersenRC,Smith,G,Irnik RJ,et al .Apolipoprtein E statrs as a predictor of thederelopment of Alzheimer’s disease in memory impaired indivedualsJAMA,1995,273:1274-1278