第十六章 血浆脂蛋白的分离纯化及定量

血浆脂蛋白和脂质测定是临床生化检验的常规测定项目，其临床意义主要是：①早期发现与诊断高脂蛋白血症；②协助诊断动脉粥样硬化症；③评价动脉粥样硬化疾患如冠心病脑梗塞等危险度；④监测评价饮食与药物治疗效果。
血浆脂蛋白测定分离的常用方法有超速离心法、沉淀分离法、电泳分离法及免疫分离法。根据脂蛋白分离纯化或定性定量等不同的需要可以选择不同的方法，如图16-1所示。
dongmaizhouyangyinghua111.jpg人血清脂蛋白的电泳和超速离心分离相应位置模式及名称比较图
图16-1 人血清脂蛋白的电泳和超速离心分离相应位置模式及名称比较图
一、超速离心法
超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白比重（密度）的差异，在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。
血浆在不同密度盐溶液中经过超速离心，各种脂蛋白按密度大小漂浮于不同盐溶液介质中。脂蛋白漂浮的恒量单位是漂浮率（Sf），Gofman等于1950年确定，血浆脂蛋白在比重为1.063的NaCl溶液中（26℃），每秒每达因克离心力的作用下的漂浮速度，称为1个Svedberg单位（10-13Sf）。Sf越大，脂蛋白密度越低。
一般操作方法是将血浆置于已准备好的不同密度梯度的盐溶媒介质中，在强大离心力作用下，各脂蛋白依其自身在不同分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层媒层，达到分离纯化的目的。
越速离心法是分离纯脂蛋白的有效技术，目前广泛应用于脂蛋白载脂蛋白代谢的研究中。
二、电泳分离法
不同脂蛋白因蛋白质含量不同，其荷电量不同，故可用电泳方法进行分离，并根据血浆脂蛋白的电泳迁移率不同予以判断、确认。电泳支持物一般常用醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。由于醋酸纤维薄膜要予处理，很繁杂，外加电泳时间过长，目前已很少使用。临床检验中主要采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，快而较为准确，仪器设备要求不高，被广泛采用。聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，分离脂蛋白，分离率高又准确，值得推荐给临床使用。
电泳分离法，不论用何种支持物，血浆脂蛋白需用亲脂染料如苏丹黑B等进行预染再电泳，电泳完毕，脂蛋白根据荷电量不同，其适移率不同，再置于光密度下进行扫描，计算出各种脂蛋白百分比，该数值乘以血浆总脂量，即可求出α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白含量。乳糜微粒停留在原点，无法测出其含量，正人空腹12h后，血浆中无CM存在。也可将电泳完毕的琼脂糖凝胶中的脂蛋白区带切割置于试管中，加水溶解，进行比色，测出各自百分比，但因其是手工半定量法，难以测准，属淘汰之列。
三、沉淀分离法
由于脂蛋白的组成及理化性质不同，在不同的聚阴离子和2价不同金属离子（Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+）以及不同pH值条件下，使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离定量各种脂蛋白的目的，如以肝素锰沉淀剂先沉淀血清中VLDL和LDL，离心，HDL在上清液里，再定量HDL量，即为血浆HDL的量。采用聚乙烯硫酸盐沉淀LDL，测定血浆的LDL量。
脂蛋白是一种既有蛋白质，又有胆固醇，还有磷脂的复合体，如何定量，目前尚无理想的方法。现在以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据。即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C）。这类测定方法是目前临床广泛使用的快速并较为准确的方法。

为了研究，常需要得到脂蛋白纯品并进一步分离纯化载脂蛋白，迄至目前为止，采用密度梯度超速离心分离纯化各种脂蛋白仍是一种很好的方法。
超速离心法可分为制备型和分析型两种，根据其所用介质密度不同，可以分为等密度离心，密度梯度离心等。根据所用转头的类型不同可以分为角头、甩平头、垂直头和区带头离心法。脂蛋白分离中，采用密度梯度超速离心法较多。
离心作用是根据稳定角速度下做圆周运动的任何物质都受到一个外向的离心力F，这种力的大小取决于角速度（以弧度ω表示）和旋转半径r（以cm计算）。
F=ω2r
F常用地球引力表示，称为相对离心力（RCF）或者常用“数字×g”来表示。
RCF=ω2r/980
在使用该公式时，这些关系需用“每min转数（r/min）”表示，这是表示离心机转动速度的普通方式。
由于（r/min）的数值可转换成弧度，利用ω=π（r/min）/30公式代入上式，得到下述换算式：
RCF-（πr/min）2×r/302/980=（1.119×10-5）（r/min）2·r
对于在离心转头中旋转的样品，估计其所受到的相对离心力需要考虑样品到旋转中心的固定距离（r）。由于转头的形状设计，离心管中从管顶主管底各点旋转中心的距离是不同的。例如在固定的角式转头中，作用于离心管顶部和底部的离心力的差别接近一倍。为了计算相对离心力的数值可用平均相对离心力（RCF平均）来表示，即同一离心转头顶部和底部所受离心力的平均值。因此，最重要的将是确定半径（r）的数值。
形成密度梯度操作，可采用两种方法，一是利用自动形成器，此装置是在一根管道上装有两个容器，各以T型管与此管道相通，两容器分别装入轻液和重液，按比例进入混合器，并用蠕动泵将溶液注入超离心管内，形成不同密度液，加入到超离心管中，使其离心管中液体成密度梯度离心分布。二是采用手工操作，先配成不同密度溶液，人工一层层铺盖到超离心管内，使超离心管中成为不同密度梯度的溶夜。
超速离心后样品的收集可根据不同的实验条件采用下述几种方法。
（1）切割法：在固定的刀架上，将已离心好的样品管放在所要求的高度（按管内分离区带确定）用刀切断离心管，取出样品。
（2）虹吸法：用蠕动泵或吸管将样品从上至下逐层按区带吸出并分管收集。泵管或吸管注意每区带一管，不能混用。
（3）穿剌法：用针头在超速离心管底部穿一小孔，让液体从底部流出，并按区带分部收集。
分管收集到的各区带样品，可采用折光仪，测出折光系数，从表中查出相应溶液的水合密度，从而确认各组份的分布样品的水合密度。

1．试剂
0.5mol/LEDTA（pH8.0）:186g EDTA-Na2加入去离水950ml，用NaOH调准pH值，再加水到1L。
溶液①（d=1.006）:NaCl 11.40g,0.5ml0.5mol/L EDTA液，加去离子水1l，EDTA可抑制脂蛋白中脂质的氧化。
溶液②（d=1.182）:NaBr24.98g溶于溶液①100ml中。
溶液③（d=1.478）:NaBr78.32溶于溶液②100ml中。
0.15mol/LNaCl,0.3mlEDTA:8.77g NaCl、0.6ml的0.5mol/l EDTA（pH8.0），再加双蒸水到1L。
d=1.019液：1.851gKBr溶于溶液①100ml中。
d=1.063液：8.343gKBr溶于溶液①100ml中。
d=1.215液：33.496gKBr溶于溶液①100ml中。
以上溶液的密度，必要时用折射仪检测。
2．操作
取10mlEDTA Na2抗凝（1mg/ml）采血，离心（3000r/min）10min，分离得血浆。取血浆4ml加入容量10ml的超离心管中的底层，上面铺盖2ml溶液①(d=1.006)液，20kr/min(26kXg)离心30min(4℃)，不用制动器让其旋转减速，以防飘浮物与下浮层相混；取出下层4ml混合血浆待用；超离心管中残留2ml，再取溶液①2ml沿管壁加入，仔细混匀分散脂蛋白，又加溶液①2ml铺在表面，20kr/min，4℃，离心1h，取出上层液直至变界处，此即CM组份。再将第一次离心所得的下层4ml混合血浆取出，其上铺2ml溶液①，40kr/min（100k×g），18℃离心17h，取上层1ml液，此即VLDL组份。再取出1ml至交界处，弃去，将管内剩余的4ml混合液移入另一超离心管内，取2ml溶液②（d=1.182）洗出离心管中残余的脂蛋白，加入到装4ml混合液超离心管内，混匀，40kr/min，18℃，离心21h，取出上层（d=1.062）1ml混合液，此即LDL组份。继续将中间层1ml除去，残存的4ml转入到另一超离心管内，用d=1.478（溶液③）2ml洗涤原管，尔后移入4ml残存液管内，仔细混匀，40kr/min，18℃，离心41h，上层（d=1.20）部分吸出，即HDL组份。下层为VHDL（very high density Lipoprotein）与其他血浆脂蛋白。LDL与HDL分别对0.15mol/lNaCl-0.3mmol/L EDTA(pH8.0)透析，4℃保存。

用EDTA抗凝血，离心得血浆，可采用大容量（300ml）超离管进行。血浆容量依次要加定量的KBr（Xg），可按下述公式计算：
dongmaizhouyangyinghua112.jpg
V为血浆容量（ml）数，d1、d2分别为该配制的最初的两种溶液密度，υ为调节密度用的KBr的目的试剂水密度的偏比容。血浆d=1.006。首先调节溶液密度到d2=1.019，离心除去。VLDL，d2=1.019的υ为0.2922，即1ml血浆中应当加KBr0.01851g，溶解后，每管注入约16ml将d=1.019溶液8ml（0.5体积）覆盖其上，40kr/min，18℃，离心16h，再除去黄色层以上的上层界面液，测量下层黄色层液ml数，再按上式计算添加0.0644g/mlKBr，以成d=1.063的溶液（υ=0.2982）同样每管（16ml）加8ml的d=1.063溶液覆盖其上，40kr/min，18℃，离心16h，取上层黄色区带，并对0.15mol/lNaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0)充分透析，该黄色脂蛋白即LDL，可用作LDL受体的配体。
添加KBr量计算式中的偏比溶（υ），d=1.019、1.063、1.125、1.210、1.215的值相应为0.2922、0.2982、0.3035、0.3090、0.3093。

1．试剂
1%DS、10%DS、2mol/L CaCl2、1mol/L K2C2O4、12%NaCl、0.2mol/l Tris-HCl、0.9%NaCl、0.01mol/L EDTA(pH7.4)
2.操作
混合血清在3000r/min下，离心30min，除去血细胞及其他固体物质，再以2000r/min离心30min（4℃），以除去血清中的CM。
取一定体积的上述血清，加1%DS，使血清中的DS浓度为0.05%，加2mol/lCaCl2，使血清中CaCl2的终浓度为0.1mol/L，搅拌后放4℃冰箱过夜，于第二天离心（3750r/min）30min，将离心后的沉淀物溶解在12%NaCl中，而后加0.2mol/l Tris-HCl缓冲液250ml（pH7.4），离心10min,弃去上清，将所得沉淀用0.02mol/l Tris-HCl再洗一次，此步骤要重复3次。将最后得到的VLDL和LDL溶解在7.5～15ml的1mol/L草酸钾中（4℃），3750r/min离心30分钟，去掉沉淀，然后将此溶液在1%NaCl，1%BaCl2溶液中透析48h（4℃）。将透析过的溶液放于离心管中去掉沉淀。把上清液再放入0.02mol/l Tris-HCl缓冲液透析72h，离心，其上清则含有较纯的VLDL和LDL

1．用途：无脂蛋白血清（lipoprotein deficient serum,LPDS）主要用于LDL受体活性测定的细胞培养。
2．操作：常规采血，室温放置1～2h，以3kr/min离心10min，分离得到血清。向血清中按每1ml加0.33496g KBr，使其血清密度为d=1.215，或者按等体积加d=1.215的KBr液，按前述两方法铺在血清上面，按40kr/min(100k×g)速度，离心40h。离心完毕，将淡黄色上层脂蛋白与无色的中间层除去，下层液上再铺d=1.215溶液，重复上述离心操作。将下层液，对0.15mol/l NaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液透析，用过滤器除菌，尔后分成小包装贮存在-20℃备用。
六、其他方法
除上述介绍的常用方法外，还有凝胶过滤和高压液相层析法分离血浆脂蛋白的方法，有关参考书很多，在此不一一介绍。

（一）原理
以聚丙烯酰胺为支持介质，血清脂质用染料预染，使脂蛋白着色，经电泳后，一般可分出三条区带，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数，乘以总脂量，可求出三种脂蛋白的含量。
（二）试剂与仪器
1．试剂
（1）分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.3g,lmol/L盐酸24ml，加水至100ml(pH8.9)。
（2）丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4g，混匀。
（3）0.35%过硫酸铵（AP）
（4）四甲基乙二胺（TEMED）
（5）丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混匀。
（6）浓缩胶缓冲液：Tris 6g、1mol/L HCl。
（7）0.002%核黄素，48ml，加水至100ml，pH6.7。
（8）电极缓冲液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。
（9）1%苏丹黑B染色液：苏丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加温至溶，离心，去除沉渣，冰箱保存备用。
（10）40%蔗糖水溶液。
2．仪器
电泳仪、光密度扫描仪
（三）操作
1．制胶
（1）先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。
（2）配制5%浓度凝胶：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm，上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面，千万别冲散凝胶界面，使凝胶与空气隔绝。静置20～40min，等凝胶凝固后，除去上层水，再加上浓缩胶。
（3）浓缩胶制备：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀，加TEMED20μl混匀，迅速加入到分离胶上层约1cm高度，沿管壁仔细加蒸馏水覆盖，千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min，也可在强光下聚合，聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。
2．血清预染与加样
在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml，摇匀，于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣，取预染血清30μl，加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面，再加一滴40%蔗糖液，混匀，然后小心地在上面加满电极缓冲液，再装在电泳槽上。
3．电泳
将电极液加入上下电泳槽内，靠样品端的上槽接负极，下槽为正极，接通电源，调节电流为2-5mA/管，30～40min后，关闭电源。
4．剥胶
从电泳槽上取下凝胶管，用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间，使凝胶与玻管内壁分离，再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪，凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。
电泳后凝胶一般出现三条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。
5．定量
浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描，计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比，即为每种脂蛋白组份的百分比。

（一）原理
以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预染，使血清脂蛋白着色，然后电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解，冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。
（二）试剂
1．巴比妥HCl缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）：称取巴比妥钠15.5g，加入1mol/LHCl12ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，此为电极缓冲液。
2．巴比妥-HCl缓冲液（pH8.6,离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g,加入1mol/LHCI8ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，用于配琼脂糖凝胶用。
3．0.8%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.8g，溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml，置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。
4．1%苏丹黑B的石油醚-乙醇（1：4，V/V）溶液。
（三）操作
1．预染血清：吸血清0.2ml于一小试管中，再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管，2000r/min离心5min，以除去多余的染料。
2．琼脂糖凝胶板制备：将0.8%琼脂糖凝胶溶解后，吸2.5ml到载玻片上，趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。
3．点样与电泳：取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl，注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液，样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳，待预染血清电泳至最高或40min，切断电源。
4．定量：
（1）切割比色法：将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内，为空白管，各管放入沸水煮3min，琼脂糖溶解，待冷，以空白管调零点，于660nm处比色，记录吸光度，以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和，比各自区带的吸光度，求其百分比。这种半定量方法不够准确，误差很大。
（2）扫描定量：预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该病人的血脂总量，即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量，如图16-2所示。
dongmaizhouyangyinghua113.jpg血清脂蛋白电泳（琼脂糖）
图16-2 血清脂蛋白电泳（琼脂糖）
正常参考值（百分比）：
α-脂蛋白 25.7±4.1%
前β-脂蛋白 21.0±4.4%
β-脂蛋白 53.3±5.3%
注意事项：①血清样品要新鲜；②为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清。

血浆中脂蛋白有多种，测定其各自的含量对于了解机体正常及疾病过程中脂质代谢状况有重要的临床意义。HDL是一组不均一的脂蛋白颗粒，其胆固醇含量占血浆总胆固醇量的25%～35%。由于血浆中所有脂蛋白均含有胆固醇，因此，只有先分离出HDL才能对其进行定量。分离HDL的方法中，沉淀法是目前临床使用最多的方法，操作简便快速。沉淀法原理是利用多聚阴离子和二价阳离子共同作用于脂蛋白，并选择性地使含ApoB的VLDL和LDL脂蛋白沉淀，再测定含HDL的上清液胆固醇，即高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。定量HDL全量是很困难的，因为它是蛋白质和脂类的混合物，故以测定HDL中所含胆固醇含量作为HDL定量依据。 要测定血清中HDL-C，就必需先沉淀HDL以外的脂蛋白，即VLDL和LDL。使血清中VLDL和LDL沉淀的试剂很多，常用的有四种：①肝素-锰沉淀法，该法操作简便易行，一旦遇上血脂升高的标本，有沉淀不完全的差异；②硫酸葡聚糖-镁法，该法也简单易行，试剂较贵而难买到；③聚乙二醇法，虽然简便易行，若遇高脂血症标本，其重复性差；④磷钼钨酸-镁法，操作简便易行，结果准确，是目前临床推荐使用的方法；⑤另有一种不沉淀VLDL和LDL也可直接测定HDL的方法，称之为直接测定法。其原理是，先用一种封阻血清VLDL和LDL，而不封阻HDL，当测胆固醇的酶试剂加入后，酶可作用于HDL的胆固醇进行化学反应，测出其浓度，但酶试剂就无法使已被试剂封阻的VLDL和LDL的胆固醇进行反应，这种直接法操作更为简便，无需离心等繁杂步骤，便于在自动生化分析仪上进行HDL-C测定，结果准确可靠，缺点是成本过高。下面仅介绍目前推荐使用的方法。 （一）原理 磷钨酸-镁（PTA-Mg2+）沉淀血清中含ApoB的脂蛋白（VLDL、LDL），上清液中只含HDL，用酶法测定上清液中胆固醇，即HDL-C。 dongmaizhouyangyinghua114.jpg 生成的醌亚胺与HDL中的CE及FC成正比。 2．试剂组成 （1）沉淀剂磷钨酸钠4g溶于50ml双蒸水中，加入1mol/l NaoH16ml，充分搅拌后，再加双水至100ml，调pH到7.6。再取40ml此溶液，加2mol/l MgCl210ml，混匀，再加水至100ml，此为应用液。 （2）胆固醇酶法测定试剂（同第十五章） （3）胆固醇标准参考液（同第十五章） 3．操作 （1）空腹12h，抽取静脉血，不抗凝，分离血清备测。于24h内操作完毕。 （2）其他操作同前。 4．注意事项 （1）室温以15～20℃为宜，＜15℃或＞30℃时应增加或减少静置时间，离心转速要恒定一致。 （2）离心沉淀后，要立即吸出上清进行测定，否则结果偏离不准。 （3）若血清TC超过500mg/dl时，上清液会出现混浊，表明有部分胆蛋白漂浮在上清液中未沉淀完全，此时将血清稀释重新沉淀，其所测值乘以稀释倍数。 （二）血清HDL-C选择遮敝直接测定法。 1．原理 含反应抑制剂的阴离子表面活性剂加入血清中后，与CM、VLDL和LDL紧密结合，少量与HDL结合。尔后，再加入反应促进剂的聚阴离子表面活性剂后，HDL溶化并释放出胆固醇，与胆固醇测定试剂进行反应，达到仅测出高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）的目的，其反应全过程为： dongmaizhouyangyinghua115.jpg 2．试剂（第一化学） RⅠ：前处理液（第一反应液） RⅡ：第二反应液（可溶性表面活性剂）及显色液 HDL-C参考血清 3．操作 按双试剂双波长法在CL-7200型全自动生化分析仪进行检测，有关参数如表16-1所示。 表16-1 HDL-C检测参数

名称	参数
分析方式	终点法
标本用量	3μl
RⅠ体积	300μl
RⅡ体积	100μl
第一试剂时间	3～4min
第二试剂时间	5～6min
双波长	[560][600]nm

标本浓度按△A=A2-A1的吸光度计算 4．特点 （1）直接测定，无需预处理。 （2）操作简便，减少影响准确性的因素。 （3）标本及试剂用量少，准确性高。 （4）抗干扰能力强，适合于自动化分析。 （5）该法CV为5%以下，回收率90%～110%。线性范围（0～5.85mmol/L）。 5．注意事项 （1）待测血清标本于当日测试，2～8℃保存，一周内测定，-20℃长期保存，对测定结果无影响。 （2）干扰物维生素C500mg/L、胆红素200mg/L、Hb5.0g/L以下均不影响测定结果。