第十九章 金免疫技术

（一）胶体金的结构 胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsol），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。 胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。 （二）胶体金的特性 1．胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。 2．呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金（2～5nm）是橙黄色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。 3．光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长，表19-1所列为部分胶体金的λmax。 （三）胶体金的制备 1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下： （1）将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。 （2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。 （3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。 （4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。 用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。 表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性

胶体金粒径（nm）	1％柠檬酸三钠加入量（ml）*	胶体金特性
呈色		λmax
16	2.00	橙色	518nm
24.5	1.50	橙红	522nm
41	1.00	红色	525nm
71.5	0.70	紫色	535nm

*还原100ml0.01％HauC14所需量 2．注意事项 （1）氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。 （2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。 （3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。 （4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。 （5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。 肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

（一）免疫金的特性
胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。
胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。
（二）免疫金的制备
1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。
在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再胶体金的pH值。
2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。
由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。
3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。
4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。
5．轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。
6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。
多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

在第十五章酶免疫测定中已叙述了斑点-ELISA和RIBA两种斑点免疫结合试验，本节介绍的两种方法（斑点金免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验）是在以上两种方法的基础上发展形成的，均以硝酸纤维素膜为固相载体，以免疫金为结合物。因其最大特点是简便快速，故统称为快速斑点免疫结合试验。

斑点免疫渗滤试验的基本原理是：以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上以液体渗滤过膜的方式迅速完成。斑点免疫渗滤试验最初是从斑点ELISA基础上发展起来建立的，应用的结合物是酶标记的，称为斑点酶免疫渗滤试验。90年代初发展了以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤试验（dotymmunogoldfiltrationassay，DIGFA），又名滴金免疫测定法（简称滴金法）。在滴金法中不需酶对底物的反应，更加简便、快速，在临床检验中应用日渐广泛。
（一）原理
以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片中央滴加纯化的抗体，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等没滤出膜片。其后加入的胶体金标记也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。
（二）试剂和操作
1．渗滤装置渗滤装置是滴金法测定中的主要试剂成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成。塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有一直径约0.4～0.8cm的小圆孔，盒内垫放吸水垫料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒盖的中央有一直径约0.40.8cm的小圆孔，盒的垫放吸水塑料，硝酸纤维素膜片安放在正对盒的圆孔下，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜片贴紧吸水垫料。如此即制备成一渗滤装置（图19-1）。塑料小盒的形状最多见的是扁平的长方形小板，加之滴金法的整个反应过程都是在渗滤装置上进行的，因此又常称渗滤装置为滴金法反应板。
2．试剂盒组成滴金法试剂盒的三个基本试剂成分是滴金法反应板、免疫金复合和洗涤液。为了提供质控保证，用于抗原测定的试剂盒还应包括抗原参照品，相应的检测抗体的试剂盒应有阳性对照品。
3．测定操作以双抗体夹心法为例，具体步骤如下：
（1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本1～2滴，待完全渗入。
（2）于小孔内滴加免疫金复合物试剂1～2滴，待完全渗入。
（3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入。
（4）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之，则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。
（三）质量控制
滴金法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵时，也可用SPA或针对金标抗体的抗抗体来充当。间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。
mianyixuehemianyixuejianyan114.jpgDIGFA渗滤装置及操作示意图mianyixuehemianyixuejianyan115.jpgDIGFA渗滤装置及操作示意图
图19-1 DIGFA渗滤装置及操作示意图
A：操作示意图B:装置分解图
有将包被斑点由圆点改成短线条式的：质控斑点横向包被成横线条，如“－”；反应斑点纵向包被成竖线条，如“∣”；两者相交成“＋”。这样，阳性反应结果在膜上显示红色的正号（＋），阴性反应结果则为负号（－），目视判断直观、明了。

（一）原理
斑点免疫层析试验（dotimmunochromatographicassay，DICA）简称免疫层析试验（ICA），也以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。
（二）试剂和操作
免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例。试验所用试剂全部为干试剂，多个试剂被组合在一个约6mm×70mm的塑料板条上，成为一单一试剂条（图19-2），试剂条上端（A）和下端（B）分别粘贴吸水材料，免疫金复合物干片粘贴在近下端（C）处，紧贴其上为硝酸纤维素膜条。硝酸纤维素膜条上有两个反应区域，测试区（T）包被有特异抗体，参照区（R）包被有抗小鼠IgG。
mianyixuehemianyixuejianyan116.jpg免疫层析试验原理示意图
图19-2 免疫层析试验原理示意图
测定时将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取液体向上端移动，流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红色反应线条（T）。过剩的免疫金复合物继续前行，至参照区与固相小鼠IgG结合（免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG），而显出红色质控线条（R）。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
斑点免疫层析试验在试剂形式和操作步骤上较前述的几种免疫测定法都更为简化，只用一个试剂，只有一步操作。

上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单份测定、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂稳定。因此特别适用于急诊检验。但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体液中不存在的物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）。目前临床检验中已开展的项目有HCG、抗HCV和抗HIV等。新项目正在不断发展中。

免疫金银染色（immunogoldsilverstaining，IGSS）是在金免疫技术基础上发展起来的更为敏感的技术，由Holgate在1983年首先建立成功。
一、原理
金免疫技术测定的产物上的金颗粒可将银离子还原成银颗粒，在金颗粒表面形成一色泽更深的黑色层，因而增强了金免疫技术的敏感性（图19-3）。
mianyixuehemianyixuejianyan117.jpg免疫金银染色原理示意图
图19-3 免疫金银染色原理示意图
二、方法
IGSS的主要试剂为银染液。以往一般用硝酸银染液，但其对光的稳定性较差；改用乙酸银溶液后稳定性加强，配方如下：
A液：0.22％乙酸银溶液（乙酸银110mg溶于去离子水50ml中）。
B液：50％阿拉伯树胶溶液（阿拉伯树胶50g溶于去离子水100ml中，每天振摇3次，5天后过滤使用）。
C液：1％对苯二酚溶液（对苯二酚500mg溶于0.55mol/LpH3.8的柠檬酸盐缓冲液50ml中）。
D液：在C液中加入B液10～40ml。
使用前将A液和D液等量混合，即为银染液。
IGSS多用于组织化学检测。对于以膜为载体的免疫学试验，金染色后的银加强可按下法进行：将膜用0.05mol/LpH8.2TBS浸洗3次，每次3min，用去离子水冲洗一次，浸入0.05mol/LpH3.8柠檬酸缓冲液平衡5min，浸入银染液中，37℃25min。将膜取出，用去离子水冲洗，放入定影液1min，去离子水冲洗，空气干燥。
三、应用
金免疫技术的敏感度低于其它标记免疫技术，经银加强染色后敏感度可与荧光免疫技术和酶免疫技术相当。因此近年来发展了不少IGSS方法以替代荧光免疫技术，可以在普通显微镜下进行检测。
在以膜为载体的免疫技术（如免疫印迹法）中，也有应用IGSS以替代酶免疫法。也有用金标记抗体代替酶标记抗体进行类似ELISA的测定，最后进行银加强，其敏感度与ELISA相仿。