第十五章 血清脂类测定

血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。
1．化学法
化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。
2．酵法测定
CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成△4胆甾烯酮和H2O2。再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。

1．原理 血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。 2．试剂组成

代号	种类	浓度	组　成	贮存2～8℃	有效时间
R1	乙醇		优质纯
R2	石油醚		沸点68℃，特级纯
R3	水醋酸		分析纯
R4	无水醋酸		胆固醇分析用，不含HCI
R5	浓硫酸		分析纯
R6	KOH液	33%(W/W)	KOH10g+H2O20ml
R7	乙醇性KOH液		R194ml+R66ml		临用前配制
R8	Liebermann				配制后
	Burchard		R420体积+R51体积+R310体积		1h
	试剂*				内用完
R9	胆固醇标准液	5.17mmol/L	胆固醇标准品200mg+R1→100ml	0

*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。 3．操作 dongmaizhouyangyinghua096.jpg血清胆固醇（Abell法）测定操作图 图15-1 血清胆固醇（Abell法）测定操作图 按图15-1操作。 4．计算 标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。 dongmaizhouyangyinghua097.jpg H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素 （一）手工测定法 1．试剂组成

代号	种类	浓度	组成	贮2～8℃	有效时间
	Na2HPO4	50mmol/L
	Na2H2PO4	50mmol/L
	胆酸钠	3mmol/L
	4-氨基安替比林	0.82mmol/L
R1*	ESPAS	14mmol/L			24h
	Carbowax-6000	0.17mmol/L
	CEH	33U/L
	COD	117U/L
	POD	6700U/L
R2	标准液	5.17mmol/L	用异丙醇溶解胆固醇

*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。 2．操作 按图15-2操作。 3．计算 标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L) （二）自动化分析仪测定 以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。 1．试剂组成 A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。 B液：COD、4-氨基安替比林等。 dongmaizhouyangyinghua098.jpg血清胆固醇测定（酶法）操作图 图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图 2．上机参数

项　目	参　数
方　法	终点法
波　长	双波长（540nm，700nm）
反应温度	37℃
试剂A反应时间	2～3min
试剂B反应时间	5～6min
样本用量	3μl
试剂A用量	250μl
试剂B用量	120μl
单位	mmol/L

3．操作过程 dongmaizhouyangyinghua099.jpg自动化分析仪测定操作过程 4．计算 以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。 5．注意事项 （1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。 （2）试剂在有效内2～8℃避光食保存。 （3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。

甘油三酯又称中性脂肪，由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸，相应称为甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）和甘油一酯（MG）。血清中90%～95%是TG，TG中结合的脂肪酸分别为油酸（44%）、软脂酸（26%）、亚油酸（16%）和棕榈油酸（7%）。
血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。
血清中TG的化学组成并不单一，准确求其分子较为困难。因标准不同，测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精（软脂精）（分子量807.3）、三油精（分子量895.4）为标准，按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。
1．化学法
化学测定法包括：①TG的抽提分离；②皂化；③甘油糖的氧化；④氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。操作较为繁杂，影响测定因素太多，本法准确性差，一般很少用。
2．酶法测定
酶法测定包括：①TG的抽提与皂化；②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。目前常规检测应用的方法有甘油激酶（glycerolkinase,GK）法和甘油氧化酶（glycerol Oxidase,GOD）法。操作简便，快速准确，并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。

1．原理 血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯，经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3，5二乙酰，1，4二氢甲基吡啶，其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比，420nm测定定量。该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。 dongmaizhouyangyinghua100.jpg 2．试剂组成

代号	种类	浓度	组成	贮2-8℃	有效时间
R1	抽提液		（CH3）CHOH（A.R）重蒸馏
R2	吸附剂		氧化铝，水洗除去微细颗粒， 110℃烤干3h以上	闭封	一周
R3	皂化剂	5%	KOH 5g+H2O→100ml
R4	醋酸溶液	2mol/L	CH3COOH 11.5ml+H2O→100ml
R5	过碘酸钠	0.05mol/L	NaIO4 1.07g+H2O→100ml
R6	氧化剂		R4 1体积+R51体积		一周
R7	醋酸铵液		CH3COONH2 15.4g+H2O→100ml
R8	显色剂		CH3COCH2COCH30.75ml+R-1
40ml+R-7 100ml+R-4 80ml
R9	参考液	2mg/dl	三油酸甘油酯 2mg+R-1→100ml（TG100mg/dl）

3．操作 按图15-3操作。 dongmaizhouyangyinghua101.jpg血清甘油三酯（乙酯丙酮法）测定操作图 图15-3 血清甘油三酯（乙酯丙酮法）测定操作图 4．计算 血清TG浓度=ESA/EST×1.13(mmol/L)

血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H2O2，H2O2与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物（quinoneimine），比色（500nm），其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。 dongmaizhouyangyinghua102.jpg （一）手工测定法 1．试剂组成

代号	种类	浓度	贮存2～8℃
R1	磷酸甘油氧化酶	≥3.0KU/L	冷藏
（A液）	抗坏血酸氧化酶	≥1.0KU/L
	甘油激酶	≥0.7KU/L
	4-氨基安替比林	80mg/L
R2	脂蛋白脂酶	≥2.0KU/L	冷藏
	过氧化物酶	≥10KU/L
	ESPAS	300mg/L
R3（参考液）	甘油酸三脂	200mg/dl（2.26mmol/L）	冷藏

*：一般采用商品试剂盒 dongmaizhouyangyinghua103.jpg血清甘油三酯测定法（酶法）操作图 图15-4 血清甘油三酯测定法（酶法）操作图 2．操作 按图15-4操作。 3．计算 血清TG浓度=ESA/EST×2.26(mmol/L) （二）生化分析仪检测 全自动生化分析仪测定操作（以CL-7200型为例）。 1．试剂 A液：GK，GPO，4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。 B液：POD，Lipase,ESPAS等。 标准液：甘油三油酸酯 200mg/dl(2.26mmol/L)。 2．上机参数

名称	参数
方法	终点法
波长	双波长（540nm 700nm）
试剂A反应时间	2～3min
试剂B反应时间	5～6min
反应温度	37℃
样本用量	4μl
试剂A用量	200μl
试剂B用量	100μl
单位	mmol/L

3．操作过程 dongmaizhouyangyinghua104.jpg生化分析仪检测操作过程 4．计算 以△A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算，自动打印结果。 5．注意事项 ①试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。 ②试剂在有效期内2～8℃避光保存。 ③样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。

磷脂（PL）并非单一的化合物，其分子内含有磷酸基的多种脂质，磷脂是这一类物质的总称。血中PL包括：①卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%～10%；②磷脂酰乙醇胺等，占2%；③鞘磷脂，占20%。
血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。
1．化学测定法过程包括：①抽提分离；②灰化；③显色、比色的三个阶段。
2．酶测定法
可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用，加水分解，测定其产物，对PL进行定量。一般多采用磷脂酶D（PL-D）进行定量。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂，这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。本法快速准确，便于自动生化分析仪器进行批量检测。

1．原理 以有机混合试剂（无水乙醇、乙醇）抽提血清中磷脂，再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物，用硝酸盐与磷反应生成有色化合物，比色定量。本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。 2．试剂组成

代号	种类	浓度	组成	贮2～8℃	有效时间
R-1	抽提液		无水乙醇：乙醇=3:1
R-2	消化液		用1L密器，加水约500ml，置冷水中缓缓加浓硫酸280ml到水中，冷却后加过氯酸（70%，AR）65ml，混匀，加蒸馏水至1000ml
R-3	显色剂		钼酸铵（A.R）2.5g+无水醋酸钠8.2g，加蒸馏水溶解并稀释至1L，监用时取此液体9份加新配的VitC液（10%）1份，混合即可
R-4	参考液（贮存液）1mg/L		称干燥KH2PO（A.R）0.4393g,溶于蒸馏水中，转移至100ml的容量中，用蒸馏水加至刻度。		冷藏
R-5	参考应用液	0.04mg/ml	取贮存液2ml加至50ml容量中，加水至刻度		冷藏

3．操作 按图15-5操作。 4．计算 血清脂性磷浓度=ESA/EST×10(mg/dl) 血清磷脂（以卵磷脂计）=ESA/EST×10×0.3229(mmol/L) dongmaizhouyangyinghua105.jpg血清磷脂测定（消化法）操作图*采用带塞玻璃试管 图15-5 血清磷脂测定（消化法）操作图*采用带塞玻璃试管

1．原理 磷脂酶D因特异性不高，能水解血清中卵磷脂，溶血卵磷脂和神经磷脂（三者占血清总磷脂的95%），释放出胆碱，胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H2O2，在过氧化物酶作用下，H2O2，4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物，其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比，在500nm波长下比色计算结果为： 2．试剂 （1）酶应用液（参考配方）：每100mlTris-His缓冲液（50mmol/L，pH7.8）中含：

磷脂酶D	45U
胆碱氧化酶	100U
过氧化物酶	220U
4-氨基安替比林	12mg
酚	20mg
CaCl2·2H2O	8mg
TritonX-100	0.2g

(2)标准液：纯卵磷脂，临用前配制，5mg/2.5ml蒸馏水（含TritonX-1000.5%） 3．操作 （1）标本采集：空腹12h抽静脉血，不抗凝，分离血清或抗凝血分离血浆。 （2）在3.0ml酶应用液中加入血清（浆）20μl，标准管加标准液20μl，空白管加水20μl，放置37℃水浴10min后，波长500nm，比色，空白管液调零。 4．计算 血清磷脂（mg/dl）=TA/SA×200 血清磷脂（mmol/L）=血清磷脂（mg/dl）×0.01292

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W9）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W6，9，12，15）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。
测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。
1．非酶法测定
非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。
2．酶测定法
主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。
dongmaizhouyangyinghua106.jpg血清主要FFA酶法测定图
图15-6 血清主要FFA酶法测定图
□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶；　PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。

1．原理 血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。 2．试剂组成

代号	种类	浓度	组成	贮存2～8℃	有效期
R-1	抽提剂		氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1（V/V）
R-2	缓冲液	33mmol/L	KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/l 50ml调pH至6.4
R-3	铜贮液	500mmol/L	Cu（NO3）2·3H2o 12.07g加H2O→100ml
R-4	三乙醇胺	1.0mol/L	三乙醇胺10ml，加水→100ml
R-5	NaOH液	1mol/L
R-6	铜试剂		R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml +H2O→100ml调pH至8.1
R-7	二苯卡 巴肼液		二苯卡巴肼（乙醇）液（4g/L）10ml+R-4 0.1ml		临用前配制
R-8	软脂酸标准贮存液	2mmol/L	软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液	冷藏
R-9	R-8的应用液	500μmol/L	用R-1液稀释	冷藏

3．操作 按图15-7操作。 4．计算 血清游离脂肪酸（μmol/L）=ESA/EST×500

1．原理 血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。 dongmaizhouyangyinghua107.jpg 2．试剂组成

代号	种类	组成	浓度贮存	贮存
R1	缓冲液	磷酸缓冲液 MgCl2液 去垢剂	0.04mmol/LpH6.9 3mol/L
R2	酶/辅酶	乙酰CoA合成酶 抗坏血酸氧化酶 CoA ATP 4-AAP 溶于10ml R1液中	≥0.3U/ml ≥1.5U/ml 0.9mmol/L 5.0mmol/L 1.5mmol/L	冷藏5日
R3	酶稀释液	苯氧乙醇 去垢剂	0.3%(V/V)
R4		马来酰亚胺 该试剂与R3等体积混合	10.6mmol/L
R5	酶试剂	乙酰CoA氧化酶 过氧化物酶 TOOS 混合上述试剂，再等体积R4试剂混合	≥10U/ml 7.5U/ml 0.2mmol/L	冷藏5日
R6	标准液		1mmol/L	冷藏

*应用带玻塞离心管 3．操作 按图15-8操作。 4．计算 dongmaizhouyangyinghua108.jpg血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图 dongmaizhouyangyinghua109.jpg血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图 图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图 dongmaizhouyangyinghua110.jpg血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图 图15-8 血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图 （胡汉宁　储建中）

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